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Cornea e occhio esterno

Coloranti oftalmici

I coloranti oftalmici (dyes in ophthalmology) sono agenti utilizzati per visualizzare selettivamente i tessuti oculari e il film lacrimale. Sono impiegati in tutti gli ambiti della pratica oftalmica, dalla diagnosi ambulatoriale all’identificazione dei tessuti in sala operatoria.

Possono essere suddivisi in due grandi categorie in base all’uso.

Coloranti per la diagnosi del segmento anteriore: I tre principali sono fluoresceina, verde lissamina e rosa bengala. Sono essenziali per rilevare lesioni epiteliali corneali e congiuntivali, valutare il film lacrimale e diagnosticare l’occhio secco.

Coloranti per il segmento posteriore e la chirurgia: Includono blu tripano, verde indocianina (ICG), triamcinolone acetonide e blu brillante G. Sono utilizzati per la colorazione della capsulorressi nella chirurgia della cataratta, la colorazione della membrana limitante interna (ILM) nella vitrectomia e l’angiografia retinica (FFA/ICGA).

Ogni colorante ha specifiche proprietà di colorazione, lunghezza d’onda di fluorescenza e affinità tissutale. È importante sceglierli in base allo scopo.

2. Principali tipi di coloranti e loro caratteristiche

Sezione intitolata “2. Principali tipi di coloranti e loro caratteristiche”

È il colorante più ampiamente utilizzato in clinica. È un colorante arancione idrosolubile, facilmente reperibile, sicuro e poco irritante.

Proprietà di fluorescenza: La lunghezza d’onda di assorbimento massima è di circa 490 nm (luce blu). Quando eccitata, emette fluorescenza giallo-verde a 520-530 nm. Si osserva applicando luce blu con un filtro blu cobalto.

Principio di colorazione: La fluoresceina non colora le cellule stesse, ma gli spazi intercellulari danneggiati. L’epitelio corneale normale ha giunzioni strette ben sviluppate e non viene quasi colorato. Vengono colorate le aree con difetti epiteliali o aumentata permeabilità all’acqua.

Forme e concentrazioni:

FormaConcentrazioneUso principale
Striscia reattiva0,6-1 mgColorazione della superficie oculare
Collirio0,5-2%Colorazione della superficie oculare
Soluzione iniettabile10–20%Angiografia retinica con fluoresceina

Principali applicazioni cliniche:

  • Rilevamento di lesioni epiteliali corneali (ulcere, erosioni, infezioni, cheratite puntata superficiale)
  • Misurazione del tempo di rottura del film lacrimale (BUT)
  • Valutazione del menisco lacrimale
  • Tonometria ad applanazione (tonometro di Goldmann)
  • Test di Seidel (verifica di perdita di umore acqueo in caso di trauma oculare perforante)
  • Test di scomparsa del colorante di Jones (verifica della pervietà del dotto nasolacrimale)
  • Angiografia retinica con fluoresceina (FFA)
  • Valutazione dell’adattamento delle lenti a contatto

A concentrazioni inferiori al 3% non provoca irritazione oculare. Per uso topico non è tossico per l’occhio ed è la prima scelta per l’esame del segmento anteriore.

È un colorante alimentare sintetico acido. Mostra un’elevata affinità di colorazione per cellule morte, cellule degenerate e filamenti di muco, e si localizza nel nucleo. La colorazione è potenziata nelle aree in cui l’adesione intercellulare è interrotta.

Caratteristiche di assorbimento: Picco di assorbimento all’estremità rossa dello spettro visibile (630 nm). Utilizzando un filtro rosso-libero, le lunghezze d’onda trasmesse vengono assorbite e le aree colorate appaiono nere.

Eccellente per visualizzare le lesioni epiteliali congiuntivali, preferito per la colorazione della congiuntiva bulbare. Utile anche per la valutazione dell’epiteliopatia del bordo palpebrale (LWE) e l’osservazione della linea di Marx.

Meno irritante e meno citotossico del rosa bengala. Negli ultimi anni si è diffuso come alternativa al rosa bengala. Tuttavia, concentrazioni superiori al 2% causano disagio. Non è compatibile con le lenti a contatto, quindi dopo l’uso è necessario risciacquare con soluzione fisiologica.

Derivato alogenato della fluoresceina. Colora l’epitelio corneale e congiuntivale privo di rivestimento mucinico e le cellule degenerate. Viene captato nelle aree in cui la protezione del film lacrimale preoculare è insufficiente.

Considerato superiore ad altri coloranti per la diagnosi precoce delle malattie della superficie oculare, è stato utilizzato per la valutazione dell’occhio secco, della cheratocongiuntivite limbare superiore e dell’herpes epiteliale. Possiede una certa attività antivirale contro il virus herpes simplex-1, ma non a scopo terapeutico oftalmico.

Tuttavia, presenta molti svantaggi. È fototossico e provoca dolore pungente e bruciore immediatamente dopo l’instillazione, anche alla concentrazione dell’1%. È necessaria l’anestesia topica prima della colorazione. La colorazione persiste facilmente sulla congiuntiva e sulla pelle perioculare; dopo l’esame è necessario un rapido risciacquo. Anche la presenza di lacrime artificiali interferisce con la captazione del colorante.

In Giappone le strisce reattive non sono disponibili in commercio; si utilizza una soluzione auto-preparata all’1%. A causa dei numerosi svantaggi rispetto ai vantaggi, l’uso quotidiano sta diminuendo e viene gradualmente sostituito dal verde lissamina o dalla colorazione con fluoresceina con filtro blu-libero.

Fluoresceina

Target: Lesioni epiteliali corneali, film lacrimale

Lunghezza d’onda di fluorescenza: Assorbimento a 490 nm → Emissione a 520–530 nm

Vantaggi: Versatile e sicuro. Facile da usare con le strisce.

Filtro: Blu cobalto + filtro blu-libero

Verde lissamina

Target: Lesioni epiteliali congiuntivali, LWE, linea di Marx

Lunghezza d’onda di assorbimento: 630 nm

Vantaggi: Ottimale per la colorazione congiuntivale. Meno irritante del rosa bengala

Filtro: Filtro rosso-libero

Rosa bengala

Target: Aree prive di mucina, epitelio degenerato

Caratteristica: Derivato alogenato della fluoresceina

Vantaggi: Eccellente per la diagnosi precoce delle malattie della superficie oculare

Svantaggi: Fototossicità. Forte irritazione, uso in diminuzione

Q Come si differenzia l'uso di fluoresceina e verde lissamina?
A

La fluoresceina è ottimale per rilevare lesioni dell’epitelio corneale e valutare il film lacrimale. Il verde lissamina è eccellente per visualizzare lesioni dell’epitelio congiuntivale, utile per valutare la lid wiper epitheliopathy e la linea di Marx. Per una valutazione precisa dell’occhio secco, a volte si esegue una ‘doppia colorazione vitale’ combinando entrambi. Si applicano contemporaneamente una striscia di fluoresceina e due strisce di verde lissamina.

Nella chirurgia del segmento posteriore o anteriore, si utilizzano coloranti per tingere tessuti difficili da visualizzare e facilitare le manovre chirurgiche.

Blu tripano: Colorante approvato dalla FDA per la colorazione capsulare anteriore (0,06%). Non attraversa la capsula, quindi la capsula anteriore è visibile in contrasto con la corticale del cristallino non colorata. Particolarmente utile in occhi con riflesso rosso ridotto o debolezza zonulare. Non tossico per l’endotelio corneale, sicuro anche nella chirurgia della cataratta pediatrica. Utilizzato anche in DSEK (cheratoplastica endoteliale con stripping della membrana di Descemet) e DALK (cheratoplastica lamellare anteriore profonda). Attenzione: le IOL acriliche idrofile possono colorarsi permanentemente.

Verde indocianina (ICG): Mostra elevata affinità per il collagene di tipo IV e la laminina, utilizzato per la colorazione della membrana limitante interna (0,05–0,5%). Per via endovenosa, il 98% si lega alle proteine plasmatiche, non diffonde fuori dai vasi e viene utilizzato nell’angiografia ICG (ICGA) per l’imaging dei vasi coroideali. La tossicità retinica dovuta alla decomposizione è un problema, aggravata dall’esposizione alla luce. L’uso intraoculare non è approvato dalla FDA. Il verde infracianina senza iodio (IFCG) è un’alternativa meno tossica in fase di studio.

Triamcinolone acetonide: Steroide sintetico non idrosolubile (40 mg/ml) che si lega come cristalli bianchi a tessuti acellulari come il vitreo e la membrana limitante interna. Facilita la visualizzazione e il distacco del vitreo posteriore durante la vitrectomia. Utile anche per confermare i filamenti vitreali in camera anteriore in caso di rottura capsulare posteriore durante la chirurgia della cataratta. Nessuna tossicità retinica riportata, ma rischio di progressione della cataratta e aumento della pressione intraoculare.

Blu brillante G: Colorante (0,025%) con affinità selettiva per la ILM, approvato dalla FDA per la colorazione della ILM. Non colora l’ERM, consentendo una ‘colorazione negativa’ in cui l’ERM risalta sullo sfondo blu della ILM in presenza di ERM. Viene anche utilizzato per la ‘doppia colorazione’ reiniettando dopo la rimozione dell’ERM per colorare la ILM. Più sicuro dell’ICG.

Blu tripano

Concentrazione: Capsulotomia anteriore 0,06%, segmento posteriore 0,15%

Target: Capsula anteriore, capsula di Tenone, ERM

FDA: Approvato

Attenzione: Colorazione permanente delle IOL idrofile

ICG

Concentrazione: EV 40 mg/2 ml, ILM 0,05–0,5%

Target: ILM, vasi coroideali (ICGA)

FDA: Non approvato per uso intraoculare

Attenzione: Tossicità retinica per degradazione

Blu brillante G

Concentrazione: Colorazione ILM 0,025%

Target: ILM (selettivo)

FDA: Approvato

Caratteristiche: Colorazione negativa e doppia colorazione

Altri coloranti, come il blu di bromofenolo (0,13–0,2%, colorazione della MLI e dell’ERM, non approvato dalla FDA) e il blu patentato (0,25%, affinità media per l’ERM e bassa per la MLI, non approvato dalla FDA), sono talvolta utilizzati nella vitrectomia con colorante. Entrambi sono considerati meno tossici per la retina rispetto all’ICG, ma i dati sono limitati.

Valutazione delle lesioni epiteliali corneali e congiuntivali

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La colorazione con fluoresceina è il metodo di esame più fondamentale per la valutazione delle patologie del segmento anteriore.

Consigli per la procedura di colorazione: Nella colorazione con fluoresceina come test lacrimale, è importante modificare il meno possibile il volume lacrimale. Applicare 1-2 gocce di soluzione fisiologica sulla striscia di fluoresceina, agitare bene e strizzare l’acqua in eccesso. Eseguire la colorazione toccando leggermente il bordo del menisco lacrimale inferiore con la striscia, senza toccare il bulbo oculare. Tenere la striscia verticalmente può ridurre ulteriormente la quantità instillata. Gli anestetici topici possono causare sottili lesioni epiteliali, quindi è meglio non usarli.

Osservazione immediatamente dopo la colorazione: Le aree di difetto epiteliale e di desquamazione dell’epitelio superficiale vengono colorate. Nell’ulcera corneale, l’estensione dell’ulcera diventa chiara, utile per valutare la gravità e la risposta al trattamento. Nelle infezioni corneali, le lesioni dendritiche della cheratite erpetica e le lesioni pseudodendritiche dell’infezione da Acanthamoeba sono chiaramente osservabili.

Colorazione ritardata: Fenomeno che si verifica 1 minuto o più dopo la colorazione. Anche in assenza di difetto epiteliale, se le giunzioni strette sono compromesse (ad esempio, per tossicità da farmaci), la fluoresceina può penetrare e diffondere nell’epitelio, causando colorazione. Ciò consente di rilevare aree di scarsa adesione nell’erosione epiteliale ricorrente, siti di invasione dell’epitelio congiuntivale nella cornea e aree di disfunzione della barriera nella cheratopatia tossica.

Osservazione delle lesioni epiteliali congiuntivali: Sulla congiuntiva, lo sfondo bianco riduce il contrasto della fluoresceina. Questo problema può essere risolto utilizzando un filtro senza blu (filtro che trasmette luce oltre 520-530 nm). Con un filtro senza blu, le lesioni epiteliali congiuntivali possono essere rilevate altrettanto bene o meglio che con la colorazione al rosa bengala, evitando così l’uso del rosa bengala.

Punteggio: Per la diagnosi e la valutazione della gravità dell’occhio secco, secondo i criteri del 2006, la colorazione viene valutata da 0 a 3 in tre quadranti (congiuntiva temporale, cornea, congiuntiva nasale), con un punteggio totale su 9; un punteggio ≥ 3 è considerato anomalo. La scala NEI (National Eye Institute) valuta la cornea in 5 zone con un punteggio da 0 a 15.

Tempo di rottura del film lacrimale (BUT): Dopo instillazione di fluoresceina, misurare il tempo in secondi dall’apertura delle palpebre alla rottura del film lacrimale. Un valore ≤5 secondi è considerato anomalo. Far chiudere leggermente le palpebre, poi aprire rapidamente; ripetere 3 volte e calcolare la media. Evitare una chiusura forte che comprime le ghiandole di Meibomio e altera lo strato lipidico.

Pattern di rottura del film lacrimale: Recentemente si è diffuso il concetto di TFOD (diagnosi orientata al film lacrimale). Durante la misurazione del BUT, il pattern di rottura del film lacrimale viene classificato in 6 tipi, utilizzati per la diagnosi dei sottotipi di occhio secco e la scelta terapeutica (TFOT).

PatternCaratteristicaPatologia suggerita
area breakRottura a chiazze esteseTipo da carenza lacrimale
line breakLinea verticale nella parte inferiore della corneaRiduzione del volume lacrimale
spot breakRottura puntiformeAnomalia della superficie corneale

L’area break indica una riduzione estrema del volume lacrimale, che richiede l’inserimento di tappi puntuali. Il line break riflette un assottigliamento del film lacrimale, mentre lo spot break riflette un’anomalia di bagnabilità della superficie corneale.

La colorazione con fluoresceina è essenziale per il tonometro ad applanazione di Goldmann. Inserendo il filtro blu e mettendo a contatto il prisma di applanazione con la cornea, si osservano due semicerchi di fluoresceina, uno superiore e uno inferiore. La pressione intraoculare viene letta regolando il tamburo in modo che i bordi interni dei due semicerchi si tocchino. La larghezza dei semicerchi dovrebbe essere circa 1/10 del diametro di 3,06 mm (circa 0,2 mm). Una colorazione eccessiva allarga i semicerchi e porta a una pressione più alta, mentre una colorazione insufficiente porta a una pressione più bassa.

Angiografia con fluoresceina (FFA): Somministrazione endovenosa di fluoresceina al 10% o 20%. Circa il 70% della fluoresceina si lega alle proteine plasmatiche, il resto rimane libero. Un filtro di eccitazione blu cobalto eccita la fluoresceina nella retina e nella coroide, e un filtro barriera giallo-verde assorbe la luce blu riflessa per fotografare solo la fluorescenza. Utilizzata per valutare molte patologie come retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica, degenerazione maculare senile e ischemia maculare. In caso di ridotta funzionalità renale, ridurre la dose alla metà o meno.

Angiografia con verde indocianina (ICGA): L’ICG si lega per il 98% alle proteine plasmatiche, quindi diffonde poco al di fuori dei vasi. Essendo eccitata dalla luce infrarossa (vicino infrarosso), si possono ottenere immagini più nitide rispetto alla FFA anche in presenza di opacità dei mezzi diottrici. Eccellente per l’imaging dei vasi coroideali, utilizzata per valutare la vasculopatia coroideale polipoide (PCV), la neovascolarizzazione coroideale e l’uveite posteriore. L’ICG viene escreta dal fegato nella bile, quindi può essere somministrata anche a pazienti in dialisi.

Precauzioni per la colorazione del segmento anteriore

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Ordine di colorazione: La colorazione con rosa bengala stessa aggrava il danno epiteliale corneale e congiuntivale, quindi eseguire sempre prima la colorazione con fluoresceina, osservare a sufficienza, quindi passare alla colorazione con rosa bengala.

Fluoresceina: Per uso topico a concentrazioni inferiori al 3% è sicura senza irritazione o tossicità oculare. Tuttavia, colora le lenti a contatto morbide, quindi evitarne l’uso durante il porto di lenti.

Verde lissamina: Non compatibile con le lenti a contatto, quindi dopo l’uso sciacquare con soluzione fisiologica.

Rosa bengala: Fototossico e la colorazione persiste facilmente, quindi dopo l’esame sciacquare rapidamente l’occhio. Eseguire un’adeguata anestesia topica prima della colorazione.

Effetti collaterali dell’angiografia retinica con fluoresceina

Sezione intitolata “Effetti collaterali dell’angiografia retinica con fluoresceina”

L’angiografia con fluoresceina (FFA) prevede la somministrazione endovenosa di fluoresceina, pertanto possono verificarsi effetti collaterali sistemici.

Dopo l’esame, l’urina diventa giallo brillante e la pelle si ingiallisce per 2-3 ore. Spiegare in anticipo che l’urina colorata può persistere fino al giorno successivo. Raramente, la fluoresceina può penetrare nella pelle e causare pseudoittero (pseudojaundice)2). In letteratura medica, sono stati riportati 11 casi di morte correlati alla fluoresceina2). Come meccanismi degli effetti collaterali sono stati proposti il riflesso vagale, l’allergia al farmaco, il rilascio di istamina, la scarica simpatica midollare correlata all’ansia e l’effetto tossico diretto di vasospasmo2).

Q Quali sono gli effetti collaterali dell'angiografia retinica con fluoresceina (FFA)?
A

Gli effetti collaterali lievi includono nausea, vomito, orticaria e prurito, che si verificano in circa il 10% dei pazienti. Quelli gravi includono lo shock anafilattico (circa 1 su 10.000), con casi di morte riportati. Dopo l’esame, si osservano temporaneamente ingiallimento cutaneo e urine colorate, ma sono innocui. Raramente è stato riportato pseudoittero con fluorescenza cutanea. Nei pazienti con diatesi allergica è necessaria particolare attenzione.

Blu tripano: Se non risciacquato rapidamente, colora il vitreo anteriore e la capsula posteriore. Di solito scompare in 1-2 settimane. Rischio di colorazione permanente delle IOL in acrilico idrofilo, non raccomandato dalla FDA.

ICG: È necessaria la filtrazione per rimuovere le particelle non disciolte. L’esposizione alla luce aggrava la tossicità retinica. Può attraversare il foro maculare e danneggiare l’EPR. Sono stati riportati depositi permanenti sulla papilla ottica. Iniettare nel segmento posteriore riempito di liquido per ridurre al minimo il contatto con la macula.

Triamcinolone: Può rimanere nel vitreo fino a 40 giorni. Rischio di progressione della cataratta e aumento della pressione intraoculare. Sono stati riportati casi di endoftalmite, ipopion e pseudoipopion.

5. Principi di colorazione e proprietà di fluorescenza

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La fluorescenza è un fenomeno per cui una molecola assorbe luce a lunghezza d’onda inferiore ed emette luce a lunghezza d’onda maggiore. La fluoresceina assorbe la luce blu intorno a 490 nm ed emette fluorescenza giallo-verde tra 520 e 530 nm.

In clinica, l’eccitazione viene effettuata con luce blu attraverso un filtro blu cobalto. Tuttavia, la trasmissione massima del filtro blu cobalto è di 390-410 nm, che non corrisponde alla lunghezza d’onda di assorbimento massimo della fluoresceina (490 nm), quindi l’eccitazione non è ottimale1). L’uso di un filtro senza blu (che trasmette sopra 520-530 nm) nel sistema di osservazione taglia la luce blu riflessa e migliora il contrasto della fluorescenza.

Fluoresceina: Il coefficiente di ripartizione olio/acqua è 0,5–0,6, quindi teoricamente può attraversare la membrana cellulare in una certa misura. Tuttavia, le cellule superficiali dell’epitelio corneale normale hanno giunzioni strette ben sviluppate, quindi non passa tra le cellule. Inoltre, la cornea normale è rivestita di mucina, quindi non viene quasi colorata. In caso di difetti epiteliali, la fluoresceina si lega alla membrana basale ed emette fluorescenza; nelle aree con funzione barriera ridotta, penetra gradualmente nel tempo (colorazione ritardata).

L’epitelio congiuntivale ha una funzione barriera più debole dell’epitelio corneale; col tempo, la fluoresceina lo attraversa e colora l’intera congiuntiva. Pertanto, i reperti devono essere rilevati immediatamente dopo la colorazione. Questa differenza di permeabilità consente di distinguere l’epitelio corneale da quello congiuntivale (visualizzazione della linea di Marx, identificazione dell’estensione dell’invasione congiuntivale).

Rosso Bengala e Verde Lissamina: Entrambi colorano l’epitelio corneocongiuntivale privo di rivestimento di mucina e le cellule degenerate. Le proprietà coloranti del Rosso Bengala e del Verde Lissamina sono quasi equivalenti, ma clinicamente il Verde Lissamina è meno irritante e più adatto per la rilevazione di danni all’epitelio congiuntivale.

ICG: Mostra un’elevata affinità per il collagene di tipo IV e la laminina. Questi sono presenti in alta concentrazione nella membrana limitante interna (ILM) della retina, quindi l’ILM viene colorata selettivamente. All’iniezione endovenosa, il 98% si lega alle proteine plasmatiche e non diffonde fuori dai vasi – questo è il principio dell’ICGA. Tuttavia, la decomposizione provoca un’ossidazione auto-sensibilizzata, causa di tossicità retinica.

Blu Brillante G: Viene incorporato selettivamente nell’ILM ma non nella membrana epiretinica (ERM). Questa proprietà consente una colorazione negativa (l’ERM risalta sullo sfondo blu dell’ILM).

La valutazione convenzionale della colorazione con fluoresceina mediante lampada a fessura presenta limitazioni come le caratteristiche di eccitazione limitate del filtro blu cobalto, la profondità di campo limitata dalla curvatura corneale, l’influenza del colore dell’iride e la dipendenza dall’osservatore 1).

Soifer e colleghi hanno ideato la «Fluoresceina Corneografia (FCG)» adattando la modalità di angiografia con fluoresceina (FA) del tomografo a coerenza ottica (OCT, Heidelberg Spectralis II) per l’imaging corneale 1). Il Spectralis II utilizza un laser a 490 nm per un’eccitazione ottimale e un filtro barriera a circa 525 nm per catturare selettivamente la fluorescenza 1). L’obiettivo 55° consente di mettere a fuoco l’intera cornea (da limbo a limbo) in un’unica immagine 1).

In una validazione su 50 pazienti con occhio secco e 10 soggetti sani, la FCG ha mostrato un’elevata concordanza inter-osservatore rispetto alle immagini con lampada a fessura. Il coefficiente di correlazione intraclasse (ICC) per il punteggio di colorazione corneale secondo la scala NEI è stato 0,96 per la FCG e 0,86 per la lampada a fessura (p<0,001) 1).

Nei pazienti con iride chiara, il punteggio dell’immagine alla lampada a fessura era significativamente più basso rispetto alla FCG (6,11 vs 8,94; p=0,026), ma nell’iride scura non c’era differenza (8,16 vs 8,25; p=0,961)1). Alla lampada a fessura, il riflesso della luce blu si confonde con l’iride chiara e ostacola il rilevamento dei PEE, mentre la FCG non dipende dal colore dell’iride1).

Poiché la FCG utilizza dispositivi OCT-FA ampiamente diffusi, ha il potenziale per realizzare la standardizzazione, quantificazione e automazione della colorazione corneale sia nella ricerca clinica che nella pratica quotidiana1).

Q In cosa differisce la fluorografia corneale con fluoresceina (FCG) dai metodi di osservazione tradizionali?
A

La FCG è una nuova tecnica che utilizza la modalità di angiografia con fluoresceina dei dispositivi OCT per l’imaging corneale. Eccitando in modo ottimale la fluoresceina con un laser a 490 nm e rimuovendo la luce riflessa con un filtro barriera, rileva i difetti epiteliali corneali con maggiore sensibilità e contrasto rispetto alla lampada a fessura. I grandi vantaggi sono l’indipendenza dal colore dell’iride e un’elevata concordanza tra gli esaminatori (ICC 0,96 vs 0,86).

  1. Soifer M, Azar NS, Blanco R, et al. Fluorescein CorneoGraphy (FCG): Use of a Repurposed Fluorescein Imaging Technique to Objectively Standardize Corneal Staining. Ocul Surf. 2023;27:77-79.
  2. Bertani R, Ferrarez CE, Perret CM, et al. The Fluorescent Patient: An Unusual Effect of Fluorescein Angiography. Cureus. 2021;13(5):e15011.
  3. Wolffsohn JS, Arita R, Chalmers R, Djalilian A, Dogru M, Dumbleton K, et al. TFOS DEWS II Diagnostic Methodology report. Ocul Surf. 2017;15(3):539-574. PMID: 28736342.

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