荧光素（fluorescein）
吸收波长：494 nm（蓝光）→ 荧光 521 nm（绿色）
染色对象：上皮细胞间紧密连接破坏的部位（细胞间隙）
主要用途：SPK 检测、BUT 测量、角膜溃疡/糜烂评估
刺激性：低（最容易使用）
观察滤光片：钴蓝 + 蓝光截止（屏障）滤光片
角膜和结膜活体染色检查（荧光素、玫瑰红等）（Ocular Surface Vital Staining）
1. 什么是角膜和结膜活体染色检查
Section titled “1. 什么是角膜和结膜活体染色检查”角膜和结膜活体染色检查（ocular surface vital staining）是一种基本的眼科检查，利用染料将眼表角膜和结膜上皮的损伤可视化，并对损伤的分布和程度进行定量评估。
主要使用以下三种染料。
- 荧光素（fluorescein）：一种荧光染料，在蓝光激发下会发出绿色荧光。是应用最广泛的染料
- 玫瑰红（rose bengal）：将死亡细胞、变性细胞和黏液染成红色的染料
- 丽沙明绿（lissamine green）：与玫瑰红具有相似染色特性的替代染料，但刺激性更小
本检查的主要目的如下：
- 检出并定量干眼中的角膜和结膜上皮损伤
- 把握感染性角膜炎中的角膜浸润和溃疡范围2)
- 评估由药物毒性、隐形眼镜损伤、眼睑异常等引起的上皮损伤
- 作为Sjögren综合征诊断的辅助（van Bijsterveld评分）3)
2016年版《干眼临床实践指南》推荐将泪膜破裂时间（BUT）测定与荧光素染色相结合的评估，作为干眼诊断的核心1)。在2006年版中，角膜和结膜上皮损伤是干眼诊断的必需条件，但在2016年版中，上皮损伤已不再是必需条件，诊断转向基于BUT缩短和自觉症状。即便如此，活体染色仍被视为客观记录上皮损伤程度和模式的重要手段1)。
在感染性角膜炎的初步评估中，荧光素染色也是用于了解角膜上皮缺损范围和形状的标准操作，并纳入基于《感染性角膜炎临床实践指南（第3版）》的诊疗中2).
Q
活体染色检查能看出什么？
2. 各种染料的特性和操作
Section titled “2. 各种染料的特性和操作”
Tagmouti A, Lazaar H, Benchekroun M, Boutaj T, Benchekroun S, Amazouzi A, et al. Association Between Thygeson Superficial Punctate Keratitis and Celiac Disease. Cureus. 2025;17(3):e80252. doi:10.7759/cureus.80252. PMID:40196095; PMCID:PMC11975144. Figure 2. PMID: 40196095; PMCID: PMC11975144; DOI: 10.7759/cureus.80252. License: CC BY.
荧光素是应用最广泛的活体染色剂。因其易于获取、安全且刺激性较小而被广泛使用。荧光素是一种在蓝光（最大吸收波长494 nm）激发下发出绿色（521 nm）荧光的染料。即使用钴蓝滤镜也能观察到，但在观察系统中加入去蓝滤镜后，可更清晰地显示病变。
染色原理与观察要点：
- 可进入并染色上皮细胞之间紧密连接（tight junction）破坏的部位
- 在钴蓝滤镜（激发494 nm）与去蓝滤镜（屏障滤镜）组合下，观察最为清晰
- 主要染色对象：点状浅表角膜病变（SPK）、角膜上皮糜烂、角膜溃疡
最小量染色法：
- 在荧光素试纸上滴1～2滴生理盐水，充分甩去多余水分
- 将湿润试纸的一端轻触下睑缘泪液河以进行染色
- 注意不要让试纸直接接触眼球（以防因过度染色造成假阴性）
- 在钴蓝滤镜下观察SPK的分布、密度和形态
玫瑰红以不同于荧光素的机制对眼表进行染色。
染色特性:
- 将死细胞、变性细胞以及失去黏蛋白保护的部位染成红色
- 正常细胞表面被分泌型黏蛋白覆盖，可防止玫瑰红渗入
- 在白光或红色滤光片下观察
- 比荧光素刺激性更强，滴眼时可能引起疼痛
van Bijsterveld 评分（玫瑰红和丽丝胺绿通用）:
- 角膜、鼻侧球结膜和颞侧球结膜三个区域分别按0～3分评分
- 总分≥3.5为阳性（用于Sjögren综合征诊断标准）3)
丽丝胺绿染色
Section titled “丽丝胺绿染色”丽丝胺绿是一种替代染料，染色特性与玫瑰孟加拉红相似，但对患者的刺激更小。
染色特性：
- 将死亡和变性的细胞染成绿色（机制与玫瑰孟加拉红相同）
- 可通过红色滤光片（560 nm 以上）清楚观察
- 滴眼时比玫瑰孟加拉红刺激更小，患者负担更轻
- 近年来，作为玫瑰孟加拉红的替代品，临床使用有增加趋势
玫瑰红
染色颜色：红色
染色对象：死细胞、变性细胞、缺乏黏蛋白保护的部位
主要用途：Sjögren综合征诊断（van Bijsterveld评分），干眼评估
刺激性：强（滴眼时会痛）
观察滤光片：白光或红色滤光片
丽丝胺绿
染色颜色：绿色
染色对象：死细胞、变性细胞（与玫瑰红相同的机制）
主要用途：玫瑰红的替代。干眼、Sjögren综合征评估
刺激性：低（对患者的负担比玫瑰红小）
观察滤光片：使用红色滤光片（560 nm及以上）更清晰
| 特性 | 荧光素 | 玫瑰红 | 利萨明绿 |
|---|---|---|---|
| 染色颜色 | 绿色荧光 | 红色 | 绿色 |
| 染色对象 | 细胞间隙（紧密连接破坏处） | 死细胞、变性细胞和黏蛋白缺失部位 | 死细胞和变性细胞 |
| 刺激性 | 低 | 高（有疼痛） | 低 |
| 观察滤镜 | 钴蓝光 + 去蓝滤镜 | 白光·红色滤镜 | 红色滤镜（560 nm以上） |
| 主要用途 | SPK・BUT测定・角膜溃疡 | Sjögren诊断・干眼 | 玫瑰孟加拉替代 |
| 代表性评分 | Oxford评分・NEI评分 | van Bijsterveld评分 | van Bijsterveld评分 |
Q
玫瑰红和丽丝明绿有什么区别？
A
两者都会染色死亡和变性细胞，但丽丝明绿刺激性更小，对患者负担更轻。玫瑰红点眼时可能引起疼痛，因此在某些情况下可能需要滴用表面麻醉药。近年来，丽丝明绿作为一种弥补这些缺点的替代染料，使用越来越广泛。观察时使用红色滤光片（560 nm以上）可更清楚地确认染色部位。
3. 评分方法与判定标准
Section titled “3. 评分方法与判定标准”
Kim S, Park D, Shin Y, et al. Deep learning-based fully automated grading system for dry eye disease severity. PLoS One. 2024;19(3):e0299776. Figure 1. PMID: 38483911; PMCID: PMC10939279; DOI: 10.1371/journal.pone.0299776. License: CC BY 4.0.
基于NEI评分将角膜分为中央、鼻上、颞上、鼻下、颞下5个区域的评估网格（双眼），以及使用实际荧光素染色照片进行评估的示例。对应正文“评分方法与判定标准”部分所述的NEI/Industry Workshop评分。
已有多种评分体系用于定量评估角结膜上皮损伤。
| 评分法 | 评估区域 | 评分范围 | 总分 | 主要用途 |
|---|---|---|---|---|
| van Bijsterveld 评分 | 角膜、鼻侧球结膜、颞侧球结膜（3个区域） | 各0～3分 | 满分9分（3.5分以上为异常） | 干燥综合征诊断标准 |
| Oxford 评分 | 角膜、球结膜（鼻侧、颞侧）（3个区域） | 各0～4分（5级） | 满分15分 | 干眼严重程度评估 |
| NEI/Industry Workshop 评分 | 角膜（5分区） | 各0～3分 | 满分15分 | 干眼临床研究 |
van Bijsterveld评分
Section titled “van Bijsterveld评分”分别对角膜、鼻侧球结膜和耳侧球结膜这3个区域按0〜3分评估（0：无染色，1：少量点状染色，2：有融合趋势的染色，3：大范围染色）。总分3.5分以上判为异常，已作为Sjögren综合征的诊断标准在国际上采用3)。
Oxford评分
Section titled “Oxford评分”将角膜和球结膜（鼻侧、耳侧）这3个区域分别按0〜4分（5级）评估，总分15分。各级与图版对照进行半定量评价。用于干眼严重度评估和治疗效果判定。
NEI/Industry Workshop评分
Section titled “NEI/Industry Workshop评分”将角膜分为中央、鼻上、耳上、鼻下、耳下5个区，各区按0〜3分评估，总分15分。广泛用于临床研究和多中心试验。
干眼诊疗指南中的角结膜上皮损伤标准（2006年版）1)：
- 荧光素染色评分3分以上
- 或 玫瑰红染色评分3分以上
- 或 利萨明绿染色评分3分以上
2016年版干眼诊断标准中，表面上皮损伤已不再是诊断的必需条件，但观察上皮损伤在干眼严重度评估和治疗效果判定中仍然发挥重要作用1)。
4. 临床意义与染色模式的解读
Section titled “4. 临床意义与染色模式的解读”点状浅表角膜病变（SPK）的评估
Section titled “点状浅表角膜病变（SPK）的评估”点状浅表角膜病变（superficial punctate keratopathy: SPK）是主诉异物感患者中最常见的眼部体征。SPK是由于某种原因导致角膜上皮受损后的“结果”，并不是病因诊断。荧光素活体染色对于检出SPK和了解其分布模式至关重要，单靠裂隙灯显微镜也能看到的细微SPK可借此显示出来。
一旦检出SPK，就应根据其分布模式积极推测病因。
SPK分布模式与病因
Section titled “SPK分布模式与病因”| 分布模式 | 主要病因 |
|---|---|
| 集中于角膜下1/3 | 干眼（泪液减少型）、倒睫 |
| 集中于角膜上1/3 | 上轮部角结膜炎（SLK）、沙眼 |
| 整个角膜（弥漫性） | 药物毒性角膜病变、病毒性角膜炎 |
| 3点至9点方向（水平带状） | 隐形眼镜（3-9点染色） |
| 角膜中央 | 睑闭合不全（兔眼）、神经麻痹性角膜炎 |
SPK病因分类
Section titled “SPK病因分类”外源性SPK：
内源性SPK：
药物毒性角膜病变的特征性染色模式
Section titled “药物毒性角膜病变的特征性染色模式”在药物毒性角膜病变中，与角膜上皮的损害相比，结膜上皮的损害较轻。这一所见可通过荧光素染色清楚确认，有助于与其他致病疾病鉴别。若整个角膜出现弥漫性SPK，则需要考虑正在使用的滴眼液（防腐剂、高浓度药物、氨基糖苷类抗菌药等）的影响2)。
感染性角膜炎中染色的意义
Section titled “感染性角膜炎中染色的意义”在感染性角膜炎中，荧光素染色可客观评估角膜上皮缺损的形状、面积和深度（根据染色深浅判断）。溃疡的范围和形状可作为选择治疗方案和随访观察的指标2)。此外，抗菌滴眼液（高浓度制剂、氨基糖苷类）较易引起角膜上皮毒性，因此在治疗过程中应通过活体染色确认是否有上皮损害加重2)。
Q
从染色模式能看出什么？
5. 相关治疗指针（按上皮损伤原因处理）
Section titled “5. 相关治疗指针（按上皮损伤原因处理）”根据活体染色所确认的上皮损伤分布和程度确定病因，并选择相应的治疗。
干眼引起的上皮损伤
Section titled “干眼引起的上皮损伤”根据《干眼诊疗指南（2016年版）》，标准治疗如下1)。
- 3%地夸磷索钠滴眼液（Diquas®）：每日点眼6次。具有促进水分分泌、促进分泌型黏蛋白（MUC5AC）分泌、增加膜型黏蛋白（MUC1、MUC4、MUC16）表达等多重作用。可改善泪液稳定性、角结膜上皮损伤和主观症状
- 2%瑞巴派特混悬滴眼液（Mucosta®）：每日点眼4次。通过增加杯状细胞数量，促进分泌型黏蛋白分泌并增加膜型黏蛋白表达。可改善角结膜上皮损伤和主观症状
- 0.1%透明质酸滴眼液：可改善角结膜上皮损伤和主观症状。适用于广泛的亚型
- 泪点栓植入：抑制泪液排出。在area break模式（泪液减少型）中为首选
感染性角膜炎引起的上皮损伤
Section titled “感染性角膜炎引起的上皮损伤”根据《感染性角膜炎诊疗指南（第3版）》，在明确致病菌后选择适当的抗菌药物2)。
- 细菌性角膜炎的初始治疗：左氧氟沙星1.5%等广谱氟喹诺酮类滴眼液
- 需注意，高浓度滴眼液和氨基糖苷类药物容易引起角膜上皮损伤2)
- 治疗过程中应通过活体染色定期确认上皮损伤的改善
药物毒性引起的上皮损伤
Section titled “药物毒性引起的上皮损伤”- 停用或更换被认为是原因的滴眼液（如含防腐剂制剂）是基本措施
- 考虑改用不含防腐剂的制剂
- 停用后通过活体染色确认上皮损害是否改善
隐形眼镜相关障碍
Section titled “隐形眼镜相关障碍”- 暂时停止佩戴隐形眼镜
- 重新评估镜片材质、含水量和佩戴时间
- 如果合并干眼，则并行进行滴眼液治疗
6. 测量原理（光学原理与染色机制）
Section titled “6. 测量原理（光学原理与染色机制）”荧光素荧光原理
Section titled “荧光素荧光原理”荧光素是一种荧光染料，吸收钴蓝光（494 nm）并发出绿色荧光（521 nm）。荧光发射的原理是光致发光，也就是把吸收的能量以光的形式再次发射出来。
蓝光阻断滤光片（屏障滤光片）会阻断激发光（约494 nm），并只让荧光波长（521 nm）通过。这样可去除背景光，使 SPK 的荧光染色更容易观察。将蓝光阻断滤光片装到裂隙灯显微镜上时，与仅使用钴蓝滤光片相比，SPK 的检出灵敏度会大幅提高。
当角膜上皮的紧密连接破坏时，荧光素会渗入细胞间隙并发出荧光。保持正常紧密连接的部位则无法让荧光素进入，因此不会染色。
玫瑰孟加拉红的染色原理
Section titled “玫瑰孟加拉红的染色原理”玫瑰孟加拉红会选择性染色未被黏蛋白保护的细胞。健康的眼表细胞表面覆盖着黏蛋白层（主要是分泌型黏蛋白MUC5AC），可阻止玫瑰孟加拉红染色。死亡或变性的细胞失去了这种黏蛋白保护，因此会被染色。与荧光素不同，它染的是死亡细胞本身，所以可作为反映眼表细胞活性的一项指标。
利萨明绿的特性
Section titled “利萨明绿的特性”利萨明绿以与玫瑰孟加拉红相似的机制染色死亡和变性的细胞。在红色滤光片（560 nm以上）下观察时，染色最清楚。与玫瑰孟加拉红相比，它对眼表刺激较小，原因被认为与其进入活组织的渗透性不同有关。
蓝色滤光片的作用
Section titled “蓝色滤光片的作用”蓝色滤光片在荧光素观察中尤其重要。即使不加滤光片，仅用钴蓝光观察也能看到病变，但加入蓝色滤光片后：
- 可去除背景光（钴蓝光的散射光）
- 只有荧光波长能到达眼底，显著提高对比度
- 更容易检出细小的SPK
- BUT测量的准确性（泪膜破裂的判定）也会提高
7. 最新研究与今后展望
Section titled “7. 最新研究与今后展望”- 采用前节OCT进行无创角膜上皮厚度绘图：利用前节光学相干断层扫描（AS-OCT）对角膜上皮厚度进行断层绘图的技术正在进步。它有可能在不使用活体染色的情况下评估角膜上皮变薄和分布不均，作为活体染色的补充或替代方案正在研究中4)
- 通过自动图像分析使染色评分客观化：染色评分（Oxford 评分、van Bijsterveld 评分等）目前仍依赖观察者的主观判断。利用 AI 和机器学习的自动评分系统正在开发中，预计可提高重复性和客观性5)
- 细化染色敏感性和特异性的研究：目前正在按干眼亚型和疾病分期评估各种染色剂的敏感性和特异性。尤其正在研究丽莎明绿与玫瑰红之间的等效性和可互换性
- 与共聚焦显微镜结合：将活体共聚焦显微镜（IVCM）与活体染色结合后，已逐渐能够从细胞水平评估上皮损伤。其在感染性角膜炎病原体鉴定中的应用也正在研究中4)
8. 参考文献
Section titled “8. 参考文献”- ドライアイ研究会診療ガイドライン作成委員会（島﨑潤, 横井則彦, 渡辺仁, 他）. ドライアイ診療ガイドライン. 日本眼科学会雑誌. 2019;123(5):489-592.
- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM, Alexander EL, Carsons SE, Daniels TE, Fox PC, Fox RI, Kassan SS, Pillemer SR, Talal N, Weisman MH, European Study Group on Classification Criteria for Sjögren’s Syndrome. Classification criteria for Sjögren’s syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann Rheum Dis. 2002;61(6):554-558. doi:10.1136/ard.61.6.554. PMID:12006334; PMCID:PMC1754137.
- Palakkamanil MM, Nichols KK. Comparison of lissamine green and rose bengal staining. Optom Vis Sci. 2015;92(5):566-571.
- Bron AJ, Evans VE, Smith JA. Grading of corneal and conjunctival staining in the context of other dry eye tests. Cornea. 2003;22(7):640-50. doi:10.1097/00003226-200310000-00008. PMID:14508260.