Nhuộm sống giác mạc và kết mạc (ocular surface vital staining) là một xét nghiệm nhãn khoa cơ bản, dùng thuốc nhuộm để làm hiện rõ tổn thương biểu mô giác mạc và kết mạc trên bề mặt mắt, đồng thời định lượng mức độ và phân bố của tổn thương.
Các thuốc nhuộm chính được sử dụng là ba loại sau.
Mục đích chính của xét nghiệm này như sau:
Trong Hướng dẫn thực hành lâm sàng về khô mắt bản 2016, đánh giá kết hợp đo thời gian phá vỡ màng phim nước mắt (BUT) và nhuộm fluorescein được khuyến cáo là phần cốt lõi của chẩn đoán khô mắt1). Ở bản 2006, tổn thương biểu mô giác mạc và kết mạc là điều kiện bắt buộc để chẩn đoán khô mắt, nhưng ở bản 2016, tổn thương biểu mô không còn là yêu cầu bắt buộc, và chẩn đoán chuyển sang dựa vào BUT ngắn và triệu chứng chủ quan. Dù vậy, nhuộm sống vẫn là một cách quan trọng để ghi nhận khách quan mức độ và kiểu tổn thương biểu mô1).
Trong đánh giá ban đầu viêm giác mạc nhiễm trùng, nhuộm fluorescein cũng là một thủ thuật tiêu chuẩn để nắm được phạm vi và hình dạng của khuyết biểu mô giác mạc, và được tích hợp vào chăm sóc theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng về viêm giác mạc nhiễm trùng (ấn bản 3)2).
Có thể nhìn thấy phân bố và mức độ tổn thương biểu mô giác mạc và kết mạc. Với fluorescein, viêm giác mạc nông chấm (SPK) và trợt/loét biểu mô giác mạc hiện lên dưới dạng huỳnh quang, còn với rose bengal hoặc lissamine green, sự phân bố của các tế bào chết và thoái hóa sẽ được nhuộm màu. Mẫu phân bố SPK có thể gợi ý bệnh nguyên nhân (khô mắt, độc tính thuốc, tổn thương liên quan đến kính áp tròng, v.v.). Cũng có thể dùng các phương pháp chấm điểm để định lượng tổn thương và theo dõi tác dụng điều trị theo thời gian.
Fluorescein là thuốc nhuộm sinh học được dùng rộng rãi nhất. Thuốc được sử dụng phổ biến vì dễ kiếm, an toàn và ít gây kích ứng. Fluorescein là một thuốc nhuộm phát ra huỳnh quang màu xanh lục (521 nm) khi được kích thích bằng ánh sáng xanh lam (bước sóng hấp thụ tối đa 494 nm). Có thể quan sát chỉ với bộ lọc xanh cobalt, nhưng tổn thương sẽ hiện rõ hơn khi thêm bộ lọc loại bỏ ánh xanh vào hệ thống quan sát.
Nguyên lý nhuộm và điểm quan sát:
Quy trình nhuộm (phương pháp lượng tối thiểu):
Rose bengal nhuộm bề mặt mắt bằng cơ chế khác với fluorescein.
Đặc điểm nhuộm:
Thang điểm van Bijsterveld (dùng cho cả rose bengal và lissamine green):
Lissamine green là một thuốc nhuộm thay thế có đặc tính nhuộm tương tự rose bengal, nhưng ít gây kích ứng cho bệnh nhân hơn.
Đặc tính nhuộm:
Fluorescein (fluorescein)
Bước sóng hấp thụ: 494 nm (ánh sáng xanh) → huỳnh quang 521 nm (màu xanh lá)
Đối tượng nhuộm: các vùng đứt gãy liên kết chặt giữa tế bào biểu mô (khoảng gian bào)
Công dụng chính: phát hiện SPK, đo BUT, đánh giá loét/mòn giác mạc
Kích ứng: thấp (dễ dùng nhất)
Bộ lọc quan sát: xanh coban + bộ lọc chặn xanh (barrier)
rose bengal
Màu nhuộm: đỏ
Đối tượng nhuộm: tế bào chết, tế bào thoái hóa, vùng mất lớp bảo vệ mucin
Ứng dụng chính: chẩn đoán hội chứng Sjögren (điểm van Bijsterveld), đánh giá khô mắt
Kích ứng: mạnh (đau khi nhỏ thuốc)
Kính lọc quan sát: ánh sáng trắng hoặc kính lọc đỏ
lissamine green
Màu nhuộm: xanh lá
Đối tượng nhuộm: tế bào chết, tế bào thoái hóa (cùng cơ chế với rose bengal)
Ứng dụng chính: thay thế cho rose bengal. Đánh giá khô mắt và hội chứng Sjögren
Kích ứng: thấp (ít gây khó chịu cho bệnh nhân hơn rose bengal)
Kính lọc quan sát: nhìn rõ hơn với kính lọc đỏ (560 nm trở lên)
| Đặc điểm | Fluorescein | Rose bengal | Lissamine green |
|---|---|---|---|
| Màu nhuộm | Huỳnh quang xanh lá | Đỏ | Xanh lá |
| Đối tượng nhuộm | Khoang gian bào (vùng các liên kết chặt bị phá vỡ) | Tế bào chết, tế bào thoái hóa và vùng thiếu mucin | Tế bào chết và tế bào thoái hóa |
| Kích ứng | Thấp | Cao (có đau) | Thấp |
| Bộ lọc quan sát | Xanh coban + không xanh | Ánh sáng trắng · bộ lọc đỏ | Bộ lọc đỏ (560 nm trở lên) |
| Mục đích chính | SPK · đo BUT · loét giác mạc | Chẩn đoán Sjögren · khô mắt | Thay thế rose bengal |
| Điểm đại diện | Điểm Oxford và NEI | Điểm van Bijsterveld | Điểm van Bijsterveld |
Cả hai đều nhuộm các tế bào chết và thoái hóa, nhưng lissamine green ít gây kích ứng hơn và dễ chịu hơn cho bệnh nhân. Rose bengal có thể gây đau khi nhỏ vào mắt, vì vậy trong một số trường hợp có thể cần gây tê tại chỗ. Lissamine green trong những năm gần đây đã được dùng rộng rãi hơn như một thuốc nhuộm thay thế để khắc phục những nhược điểm này. Khi quan sát, dùng bộ lọc đỏ (560 nm trở lên) sẽ giúp nhìn rõ vùng nhuộm hơn.
Đã có nhiều hệ thống chấm điểm được thiết lập để định lượng tổn thương biểu mô giác mạc-kết mạc.
| Phương pháp chấm điểm | Vùng đánh giá | Khoảng điểm | Tổng | Công dụng chính |
|---|---|---|---|---|
| điểm van Bijsterveld | giác mạc, kết mạc củng mạc phía mũi, kết mạc củng mạc phía thái dương (3 vùng) | mỗi vùng 0–3 điểm | tối đa 9 điểm (bất thường khi từ 3,5 điểm trở lên) | tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng Sjögren |
| điểm Oxford | giác mạc, kết mạc củng mạc (phía mũi và phía thái dương) (3 vùng) | mỗi vùng 0–4 điểm (5 mức) | tối đa 15 điểm | đánh giá mức độ khô mắt |
| điểm NEI/Industry Workshop | giác mạc (5 phần) | mỗi vùng 0–3 điểm | tối đa 15 điểm | nghiên cứu lâm sàng về khô mắt |
Mỗi trong 3 vùng — giác mạc, kết mạc củng mạc phía mũi và kết mạc củng mạc phía thái dương — được đánh giá từ 0 đến 3 điểm (0: không nhuộm màu, 1: vài đốm nhuộm điểm, 2: nhuộm có xu hướng kết tụ, 3: nhuộm lan rộng). Tổng điểm từ 3,5 trở lên được xem là bất thường và đã được quốc tế chấp nhận làm tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng Sjögren3).
Ba vùng — giác mạc và kết mạc củng mạc (phía mũi và phía thái dương) — được chấm riêng từ 0 đến 4 điểm (5 mức), tổng cộng 15 điểm. Mỗi mức được đánh giá bán định lượng bằng cách đối chiếu với hình minh họa. Được dùng để đánh giá mức độ khô mắt và hiệu quả điều trị.
Giác mạc được chia thành 5 vùng: trung tâm, trên mũi, trên thái dương, dưới mũi và dưới thái dương, và mỗi vùng được chấm từ 0 đến 3 điểm, tổng cộng 15 điểm. Phương pháp này được dùng rộng rãi trong nghiên cứu lâm sàng và các thử nghiệm đa trung tâm.
Tiêu chí tổn thương biểu mô giác mạc-kết mạc trong Hướng dẫn thực hành lâm sàng về khô mắt (bản 2006)1)：
Trong tiêu chuẩn chẩn đoán khô mắt bản 2016, tổn thương biểu mô không còn là yêu cầu bắt buộc để chẩn đoán, nhưng việc quan sát tổn thương biểu mô vẫn giữ vai trò quan trọng trong đánh giá mức độ khô mắt và xác định hiệu quả điều trị1).
Bệnh giác mạc chấm nông (superficial punctate keratopathy: SPK) là dấu hiệu ở mắt thường gặp nhất ở bệnh nhân than phiền cảm giác có dị vật. SPK là “hậu quả” của tổn thương biểu mô giác mạc do một nguyên nhân nào đó, không phải là chẩn đoán nguyên nhân. Nhuộm màu sống bằng fluorescein là cần thiết để phát hiện SPK và hiểu kiểu phân bố của nó, đồng thời có thể cho thấy những SPK rất nhỏ không thể nhìn thấy chỉ bằng kính hiển vi đèn khe.
Khi phát hiện SPK, điều quan trọng là chủ động suy đoán bệnh nguyên nhân từ kiểu phân bố của nó.
| Kiểu phân bố | Bệnh nguyên nhân chính |
|---|---|
| Tập trung ở 1/3 dưới của giác mạc | Khô mắt (thể giảm tiết nước mắt), quặm mi |
| Tập trung ở 1/3 trên của giác mạc | Viêm giác mạc kết mạc vùng rìa trên (SLK), mắt hột |
| Toàn bộ giác mạc (lan tỏa) | Bệnh giác mạc độc do thuốc, viêm giác mạc do virus |
| Hướng từ 3 đến 9 giờ (dải ngang) | Kính áp tròng (nhuộm màu 3-9 o’clock) |
| Giác mạc trung tâm | Hở mi (lagophthalmos), viêm giác mạc liệt thần kinh |
SPK ngoại sinh:
SPK nội sinh:
Trong bệnh giác mạc độc do thuốc, tổn thương ở biểu mô kết mạc ít hơn so với tổn thương ở biểu mô giác mạc. Dấu hiệu này có thể được xác nhận rõ bằng nhuộm fluorescein và hữu ích để phân biệt với các bệnh nguyên nhân khác. Nếu thấy SPK lan tỏa trên toàn bộ giác mạc, cần cân nhắc ảnh hưởng của thuốc nhỏ mắt đang dùng (chất bảo quản, thuốc nồng độ cao, kháng sinh nhóm aminoglycoside, v.v.)2).
Trong viêm giác mạc nhiễm trùng, nhuộm fluorescein giúp đánh giá khách quan hình dạng, diện tích và độ sâu (đánh giá theo mức độ đậm của màu nhuộm) của khuyết biểu mô giác mạc. Phạm vi và hình dạng của ổ loét được dùng làm chỉ dấu để lựa chọn điều trị và theo dõi diễn tiến2). Ngoài ra, thuốc nhỏ mắt kháng khuẩn (chế phẩm nồng độ cao, aminoglycoside) dễ gây độc tính cho biểu mô giác mạc, vì vậy cần kiểm tra bằng nhuộm sinh học xem có tình trạng tổn thương biểu mô nặng lên trong quá trình điều trị hay không2).
Quan sát kiểu phân bố của SPK có thể suy ra bệnh nguyên nhân. SPK tập trung ở phần dưới giác mạc gợi ý khô mắt hoặc quặm mi, SPK ở phần trên gợi ý SLK và đau mắt hột, còn SPK lan tỏa khắp giác mạc gợi ý độc tính do thuốc hoặc viêm giác mạc do virus. SPK ở vị trí từ 3 giờ đến 9 giờ đặc trưng cho tổn thương do kính áp tròng, còn SPK ở trung tâm giác mạc đặc trưng cho hở mi và viêm giác mạc liệt thần kinh. SPK thực chất chỉ là “kết quả” của tổn thương biểu mô, và việc dùng kiểu phân bố làm manh mối để tìm nguyên nhân là điểm then chốt trong thực hành.
Xác định nguyên nhân từ phân bố và mức độ tổn thương biểu mô được xác nhận bằng nhuộm sinh học, rồi chọn điều trị phù hợp với nguyên nhân.
Điều trị tiêu chuẩn dựa trên Hướng dẫn điều trị khô mắt (bản 2016) như sau1).
Dựa trên Hướng dẫn điều trị viêm giác mạc nhiễm trùng (ấn bản thứ 3), chọn thuốc kháng khuẩn phù hợp sau khi xác định được tác nhân gây bệnh2).
Fluorescein là một chất nhuộm huỳnh quang, hấp thụ ánh sáng xanh cobalt (494 nm) và phát ra huỳnh quang màu xanh lá (521 nm). Nguyên lý phát huỳnh quang là quang phát quang, trong đó năng lượng hấp thụ được phát ra lại dưới dạng ánh sáng.
Bộ lọc chặn ánh sáng xanh (bộ lọc chắn) chặn ánh sáng kích thích (khoảng 494 nm) và chỉ cho bước sóng huỳnh quang (521 nm) đi qua. Nhờ đó, ánh sáng nền được loại bỏ và sự nhuộm fluorescein của SPK trở nên dễ quan sát hơn. Khi gắn bộ lọc chặn ánh sáng xanh vào kính hiển vi đèn khe, độ nhạy phát hiện SPK tăng lên rõ rệt so với chỉ dùng bộ lọc xanh cobalt.
Khi các tight junction của biểu mô giác mạc bị phá vỡ, fluorescein sẽ thấm vào khoảng gian bào và phát huỳnh quang. Những vùng còn giữ được tight junction bình thường thì fluorescein không vào được và không bắt màu.
Rose bengal chọn lọc nhuộm các tế bào không được bảo vệ bởi mucin. Các tế bào bề mặt mắt khỏe mạnh được phủ bởi một lớp mucin (chủ yếu là mucin tiết MUC5AC), giúp ngăn nhuộm rose bengal. Các tế bào chết và thoái hóa đã mất lớp bảo vệ mucin này nên sẽ bị nhuộm. Khác với fluorescein, chất này nhuộm chính các tế bào chết, vì vậy có thể xem là một chỉ dấu phản ánh khả năng sống của tế bào bề mặt mắt.
Lissamine green nhuộm các tế bào chết và thoái hóa bằng cơ chế tương tự rose bengal. Hình ảnh nhuộm thấy rõ nhất khi quan sát dưới bộ lọc đỏ (560 nm trở lên). Người ta cho rằng nó gây kích thích bề mặt mắt ít hơn rose bengal vì khả năng thấm vào mô sống khác nhau.
Bộ lọc xanh đặc biệt quan trọng khi quan sát fluorescein. Ngay cả khi không có bộ lọc, vẫn có thể thấy tổn thương bằng ánh sáng xanh cobalt, nhưng khi thêm bộ lọc xanh:
