Xét nghiệm tế bào học và nuôi cấy kết mạc (xét nghiệm nhiễm trùng và dị ứng)
1. Tế bào học và nuôi cấy bệnh phẩm cạo kết mạc là gì
Phần tiêu đề “1. Tế bào học và nuôi cấy bệnh phẩm cạo kết mạc là gì”Tế bào học từ bệnh phẩm cạo kết mạc và nuôi cấy vi sinh là các xét nghiệm dùng để xác định tác nhân gây bệnh trong các bệnh mắt nhiễm trùng, làm xét nghiệm độ nhạy thuốc và xác nhận eosinophil trong bệnh kết mạc dị ứng (chẩn đoán xác định). Khi xác định sớm tác nhân gây bệnh và chọn kháng sinh hiệu quả, có thể kỳ vọng các dấu hiệu nhiễm trùng sẽ cải thiện.
Hướng dẫn Chẩn đoán và Điều trị Viêm Giác mạc Nhiễm trùng (phiên bản 3) khuyến cáo mạnh mẽ thực hiện soi phết và nuôi cấy khi nghi ngờ viêm giác mạc nhiễm trùng (mức độ bằng chứng: C)1). Đây được xem là xét nghiệm thiết yếu, đặc biệt trong các trường hợp viêm giác mạc hoặc viêm nội nhãn cần xử trí khẩn cấp, hoặc khi nghi ngờ có tác nhân gây bệnh hiếm gặp.
Trong Hướng dẫn Chẩn đoán và Điều trị Bệnh Kết Mạc Dị Ứng (phiên bản 3), xét nghiệm eosinophil (nhuộm Hansel) được nêu rõ là cơ sở của chẩn đoán xác định, và là xét nghiệm không thể thiếu để chuyển từ chẩn đoán lâm sàng sang chẩn đoán xác định2).
Chỉ định
Phần tiêu đề “Chỉ định”Khi nghi ngờ bệnh nhiễm trùng
Phần tiêu đề “Khi nghi ngờ bệnh nhiễm trùng”- Viêm giác mạc và viêm kết mạc do vi khuẩn (đặc biệt cần xử trí khẩn cấp)
- Viêm kết mạc do lậu cầu (chẩn đoán sớm rất quan trọng vì có thể gây thủng giác mạc)
- Viêm giác mạc do Acanthamoeba (khó nuôi cấy tại các cơ sở thông thường, nên khuyến nghị soi kính hiển vi)
- Viêm giác mạc do nấm
- Các trường hợp nghi ngờ tác nhân gây bệnh đặc biệt (như viêm giác mạc dai dẳng hoặc kháng điều trị)
Chẩn đoán xác định các bệnh mắt dị ứng
Phần tiêu đề “Chẩn đoán xác định các bệnh mắt dị ứng”- Viêm kết mạc dị ứng (chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm bạch cầu ái toan)
- Viêm kết mạc giác mạc mùa xuân (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Viêm kết mạc giác mạc cơ địa (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Chủ yếu được thực hiện vì hai mục đích. Thứ nhất, khi nghi ngờ viêm giác mạc hoặc viêm kết mạc do nhiễm trùng; đây là xét nghiệm bắt buộc, đặc biệt trong các nhiễm trùng cấp như viêm giác mạc và viêm nội nhãn, hoặc khi nghi ngờ các tác nhân gây bệnh đặc biệt như lậu cầu, Acanthamoeba hay nấm. Thứ hai, để xác định bệnh kết mạc dị ứng; chỉ cần phát hiện 1 bạch cầu ái toan bằng nhuộm Hansel là có thể chẩn đoán xác định. Chỉ dựa vào dấu hiệu lâm sàng thì chỉ có thể đưa ra chẩn đoán lâm sàng, nên khi cần chẩn đoán xác định sẽ làm xét nghiệm bạch cầu ái toan.
2. Kỹ thuật lấy mẫu
Phần tiêu đề “2. Kỹ thuật lấy mẫu”Nguyên tắc là lấy mẫu kỹ từ vị trí nghi ngờ có tác nhân gây bệnh. Thời điểm lấy mẫu ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ dương tính. Tỷ lệ dương tính của cấy trước khi dùng kháng sinh là 77,3%, trong khi sau điều trị giảm còn 37,8% 1). Phải lấy mẫu trước khi dùng kháng sinh.
Chuẩn bị và quy trình
Phần tiêu đề “Chuẩn bị và quy trình”- Gây tê: Dùng thuốc tê nhỏ mắt. Ưu tiên loại không chứa chất bảo quản (để tránh ảnh hưởng của chất bảo quản lên vi sinh vật)
- Dụng cụ lấy mẫu: que Kimura hoặc dao golf (để cạo kết mạc và giác mạc). Hoặc tăm bông sợi tổng hợp
- Vị trí lấy mẫu: cạo ở ranh giới giữa tổn thương và mô bình thường. Vì vi khuẩn nằm ở rìa giữa vùng viêm và giác mạc bình thường, nên vùng ranh giới đó là phù hợp nhất
- Ngăn khô: khi lấy bằng tăm bông, hãy làm ẩm tăm bông trước bằng nước muối sinh lý vô khuẩn. Khô làm giảm chất lượng mẫu
- Chất liệu tăm bông: dùng loại sợi tổng hợp. Chất liệu tự nhiên có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và phương pháp xét nghiệm
Lưu ý
Phần tiêu đề “Lưu ý”- Có những trường hợp tổn thương rất dễ vỡ. Không cạo quá mạnh
- Có báo cáo cho thấy tỷ lệ dương tính của cấy khi cạo tổn thương bằng tăm bông khoảng 50%, còn với kim 23G là 35% 1)
- Nếu lượng mẫu ít, hãy ghi rõ ưu tiên xét nghiệm cho phòng xét nghiệm
Điều quan trọng nhất là lấy mẫu trước khi dùng kháng sinh. Sau khi dùng kháng sinh, tỷ lệ cấy dương tính giảm mạnh từ 77,3% xuống 37,8%. Vị trí lấy mẫu là vùng ranh giới giữa tổn thương và mô bình thường; cạo ở rìa chứ không phải trung tâm viêm. Đầu tăm bông nên được làm ẩm trước bằng dung dịch muối sinh lý vô trùng để tránh khô. Dụng cụ lấy mẫu có thể dùng tăm bông sợi tổng hợp hoặc Kimura spatula hay golf knife, và thực hiện dưới gây tê nhỏ mắt. Nếu tổn thương dễ vỡ, không cạo mạnh.
3. Phiến đồ và xét nghiệm hiển vi (phương pháp nhuộm và đánh giá)
Phần tiêu đề “3. Phiến đồ và xét nghiệm hiển vi (phương pháp nhuộm và đánh giá)”
Mẫu đã lấy được phết lên lam kính, nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Tỷ lệ dương tính của xét nghiệm phiến đồ-hiển vi được báo cáo là 58,1–73,7%1).
Quy trình chuẩn bị mẫu
Phần tiêu đề “Quy trình chuẩn bị mẫu”- Lau sạch lam kính bằng cồn và đánh dấu mặt sau vùng phết mẫu bằng bút kim cương hoặc bút dạ
- Trải vật liệu thành lớp mỏng, dàn nhẹ nhàng. Với tăm bông, nếu lượng mẫu ít thì phết như đóng dấu bằng cách ấn nhẹ; nếu lượng đủ thì phết bằng cách lăn
- Cố định bằng cồn methylic hoặc bằng ngọn lửa
Lựa chọn phương pháp nhuộm
Phần tiêu đề “Lựa chọn phương pháp nhuộm”Chọn một trong 5 phương pháp nhuộm tùy theo mục đích.
- Nhuộm Giemsa (Diff-Quik™): phương pháp nhuộm đa dụng dùng cho sàng lọc, bao gồm cả nguyên nhân nhiễm và không nhiễm. Với bộ nhuộm nhanh (Diff-Quik™), có thể thu được màu nhuộm tương đương phương pháp thông thường chỉ trong khoảng 15 giây. Tất cả vi sinh vật đều bắt màu xanh, nhưng không thể phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm1)
- Nhuộm Gram: phương pháp nhuộm chuyên biệt cho nhiễm khuẩn. Có thể phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm, đồng thời quan sát hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn hoặc trực khuẩn). Nếu dùng Faver G (Nissui Pharmaceutical), có thể hoàn thành trong khoảng 3 phút1)
- Nhuộm FungiFloraY®: thuốc nhuộm huỳnh quang thuộc nhóm axit stilben sulfonic. Thuốc nhuộm chọn lọc các polysaccharide liên kết β (chitin và cellulose) và phát hiện nhạy nấm (sợi nấm và nấm men) cũng như bào nang Acanthamoeba. Cần quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang1)
- Miễn dịch huỳnh quang: chứng minh trực tiếp các kháng nguyên virus như HSV (virus herpes simplex) và VZV (virus varicella-zoster)1)
- Nhuộm Hansel: phương pháp nhuộm chuyên biệt dùng để phát hiện bạch cầu ái toan trong bệnh kết mạc dị ứng
Độ phóng đại khi soi kính hiển vi
Phần tiêu đề “Độ phóng đại khi soi kính hiển vi”- 400x: dùng để xác định loại tế bào viêm (bạch cầu trung tính có đường kính khoảng 12–15 μm). Trong nhiễm khuẩn, bạch cầu trung tính chiếm ưu thế; trong nhiễm virus, lympho bào chiếm ưu thế
- 1000x với dầu soi kính: dùng để quan sát vi sinh vật (đường kính vi khuẩn khoảng 1,0 μm)
Phương pháp nhuộm và các dấu hiệu đặc trưng theo từng tác nhân gây bệnh
Phần tiêu đề “Phương pháp nhuộm và các dấu hiệu đặc trưng theo từng tác nhân gây bệnh”| Tác nhân gây bệnh nghi ngờ | Phương pháp nhuộm được khuyến nghị | Các dấu hiệu đặc trưng |
|---|---|---|
| Vi khuẩn (chung) | Nhuộm Gram | Cầu khuẩn và trực khuẩn Gram dương/Gram âm |
| Lậu cầu khuẩn | Diff-Quik™ | Song cầu khuẩn hình hạt cà phê; ở trong bạch cầu trung tính |
| Nấm | Fungiflora Y® | Sợi nấm và bào tử đính (huỳnh quang) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Nang hai lớp vỏ (khoảng 10×10 μm) |
| Vi-rút (như HSV) | Phương pháp kháng thể huỳnh quang | Huỳnh quang đặc hiệu trong tế bào nhiễm |
| Bạch cầu ái toan (dị ứng) | Nhuộm Hansel | Dương tính ngay cả khi chỉ có 1 bạch cầu ái toan |
4. Xét nghiệm nuôi cấy
Phần tiêu đề “4. Xét nghiệm nuôi cấy”Trong xét nghiệm nuôi cấy, vi sinh vật gây bệnh được nuôi trên môi trường nuôi cấy, giúp định danh và làm xét nghiệm độ nhạy thuốc. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính thay đổi theo cơ sở và điều kiện, từ 37,6 đến 74,3% 1). Vì ở bề mặt ngoài của mắt có vi khuẩn thường trú, vi khuẩn được phân lập không nhất thiết là tác nhân gây bệnh. Cần đánh giá tổng hợp dựa trên kết quả soi kính hiển vi, khám mắt, độ nhạy thuốc và đáp ứng điều trị.
Các loại môi trường nuôi cấy chính
Phần tiêu đề “Các loại môi trường nuôi cấy chính”| Môi trường nuôi cấy | Vi sinh vật đích | Điều kiện nuôi cấy |
|---|---|---|
| môi trường thạch máu | vi khuẩn thường gặp (có thể đánh giá tan máu) | 37°C, hiếu khí |
| môi trường thạch chocolate | Haemophilus và lậu cầu (chứa yếu tố V và X) | 37°C, CO2 |
| môi trường Sabouraud/có dextrose từ khoai tây | nấm | nuôi cấy ở hai điều kiện: 37°C và nhiệt độ phòng |
| đĩa thạch NN 1,5% | Acanthamoeba | 30°C |
| Môi trường vận chuyển (Seed Swab®, Transwab®, v.v.) | Vi khuẩn thường gặp (khi cơ sở không có môi trường rắn) | Vận chuyển ở nhiệt độ phòng (tỷ lệ dương tính 50–69%)1) |
Bảo quản bệnh phẩm
Phần tiêu đề “Bảo quản bệnh phẩm”Cách bảo quản bệnh phẩm khi cần thời gian để chuyển đến phòng xét nghiệm sẽ khác nhau tùy loại tác nhân gây bệnh.
- Vi khuẩn thường gặp: Bảo quản ở 4°C (tủ lạnh)
- Lậu cầu và não mô cầu: Bảo quản ở nhiệt độ phòng vì dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ thấp và dễ chết
- Nếu nghi vi khuẩn kỵ khí bắt buộc: Bảo quản trong dụng cụ vận chuyển kỵ khí
Điểm cần lưu ý khi chỉ định xét nghiệm
Phần tiêu đề “Điểm cần lưu ý khi chỉ định xét nghiệm”- Ghi rõ các dấu hiệu lâm sàng và vi sinh vật mục tiêu trên phiếu yêu cầu. Thêm môi trường chọn lọc giúp tăng tỷ lệ phát hiện
- Nếu lượng mẫu ít, hãy ghi thứ tự ưu tiên xét nghiệm (ví dụ: nuôi cấy > soi kính hiển vi, vi khuẩn > nấm)
Diễn giải xét nghiệm độ nhạy thuốc
Phần tiêu đề “Diễn giải xét nghiệm độ nhạy thuốc”Trong xét nghiệm độ nhạy thuốc, thường chọn thuốc có MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) thấp hơn trong số các thuốc được đánh giá là S (nhạy cảm). Tuy nhiên, ngay cả khi được đánh giá là R (kháng), thuốc vẫn có thể có hiệu quả lâm sàng, vì vậy cần đánh giá toàn diện. Lưu ý rằng với xét nghiệm độ nhạy thuốc đối với nấm và Acanthamoeba, tiêu chuẩn diễn giải vẫn chưa được xác lập 1).
Tỷ lệ nuôi cấy dương tính là 37.6–74.3%, và kết quả âm tính không loại trừ nhiễm trùng. Yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất là thời điểm lấy mẫu; nếu lấy sau khi dùng kháng sinh, tỷ lệ dương tính giảm còn khoảng một nửa. Ngoài ra, tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở các trường hợp soi lam âm tính là 42.7–47.1%, và ở các trường hợp soi lam dương tính là 57.1–82.4%, vì vậy kết hợp cả hai xét nghiệm sẽ nâng cao độ chính xác chẩn đoán. Do Acanthamoeba khó phân lập và nuôi cấy tại các cơ sở thông thường, nên ưu tiên soi kính hiển vi với nhuộm Diff-Quik™ để xác nhận cấu trúc hai lớp vỏ của nang.
5. Xét nghiệm bạch cầu ái toan (chẩn đoán xác định bệnh kết mạc dị ứng)
Phần tiêu đề “5. Xét nghiệm bạch cầu ái toan (chẩn đoán xác định bệnh kết mạc dị ứng)”
Để chẩn đoán xác định bệnh kết mạc dị ứng, cần phát hiện bạch cầu ái toan trong phiến phết cạo kết mạc nhuộm Hansel 2).
Kỹ thuật lấy mẫu
Phần tiêu đề “Kỹ thuật lấy mẫu”- Sau khi gây tê tại chỗ, lộn mí mắt trên
- Xoa nhẹ kết mạc mi bằng que thủy tinh, và lấy chất nhầy đọng trên bề mặt kết mạc bằng kẹp hoặc spatula
- Phết lên lam kính, nhuộm Hansel, và quan sát dưới kính hiển vi quang học
Diễn giải
Phần tiêu đề “Diễn giải”Nếu nhìn thấy dù chỉ một bạch cầu ái toan dưới kính hiển vi, kết quả được xem là dương tính và trở thành chẩn đoán xác định của bệnh kết mạc dị ứng2). Nếu có chảy máu khi lấy mẫu, bạch cầu ái toan trong máu có thể lẫn vào mẫu, vì vậy cần xét nghiệm lại ở mắt còn lại.
Hệ thống chẩn đoán bệnh kết mạc dị ứng
Phần tiêu đề “Hệ thống chẩn đoán bệnh kết mạc dị ứng”Ba bước chẩn đoán dựa trên Hướng dẫn thực hành lâm sàng bệnh kết mạc dị ứng (ấn bản thứ 3) như sau2).
| Phân loại chẩn đoán | Điều kiện cần |
|---|---|
| Chẩn đoán lâm sàng | Chỉ có các dấu hiệu lâm sàng (triệu chứng và dấu hiệu dị ứng) |
| Chẩn đoán lâm sàng xác định | Dấu hiệu lâm sàng + xác nhận cơ địa dị ứng (IgE toàn phần trong nước mắt dương tính, test da, IgE đặc hiệu với kháng nguyên trong huyết thanh dương tính) |
| Chẩn đoán xác định | Dấu hiệu lâm sàng + xét nghiệm bạch cầu ái toan dương tính (xác nhận phản ứng dị ứng tại chỗ ở mắt) |
Chẩn đoán lâm sàng xác định chỉ xác nhận cơ địa dị ứng toàn thân, chứ không trực tiếp chứng minh phản ứng dị ứng tại mắt. Chỉ khi xét nghiệm bạch cầu ái toan trực tiếp chứng minh phản ứng dị ứng tại chỗ ở mắt thì mới được xem là chẩn đoán xác định2).
6. Diễn giải kết quả xét nghiệm và đánh giá tổng thể
Phần tiêu đề “6. Diễn giải kết quả xét nghiệm và đánh giá tổng thể”Ước đoán tác nhân gây bệnh dựa trên loại tế bào viêm
Phần tiêu đề “Ước đoán tác nhân gây bệnh dựa trên loại tế bào viêm”Ngay cả khi không tìm thấy vi khuẩn, loại tế bào viêm vẫn có thể là manh mối để ước đoán tác nhân gây bệnh.
- Ưu thế bạch cầu trung tính → gợi ý nhiễm khuẩn
- Ưu thế lympho bào → gợi ý nhiễm virus
- Ưu thế bạch cầu ái toan → gợi ý nhiễm dị ứng hoặc ký sinh trùng
Đánh giá tổng thể tác nhân gây bệnh
Phần tiêu đề “Đánh giá tổng thể tác nhân gây bệnh”Việc vi khuẩn được phân lập có phải là tác nhân gây bệnh hay không được đánh giá một cách tổng hợp.
- Sự tương đồng giữa kết quả soi và vi khuẩn phân lập từ nuôi cấy (vi khuẩn thấy khi soi có trùng với vi khuẩn phát triển trong nuôi cấy hay không)
- Sự phù hợp với tổn thương ở mắt (mẫu có được lấy từ vị trí tổn thương hay không)
- Sự phù hợp giữa kết quả xét nghiệm độ nhạy thuốc và hiệu quả điều trị thực tế
Chú ý đến các tác nhân gây bệnh đặc biệt
Phần tiêu đề “Chú ý đến các tác nhân gây bệnh đặc biệt”- lậu cầu: dễ bị khô và thay đổi nhiệt độ làm chết. Cần xử lý ngay sau khi lấy mẫu. Bảo quản lạnh là không phù hợp (bảo quản ở nhiệt độ phòng)
- Acanthamoeba: việc phân lập và nuôi cấy khó thực hiện ở các cơ sở thông thường. Với nhuộm Dif-Quik™, cần ưu tiên xác nhận nang có thành kép
Kết hợp soi kính hiển vi phết bệnh phẩm và xét nghiệm nuôi cấy
Phần tiêu đề “Kết hợp soi kính hiển vi phết bệnh phẩm và xét nghiệm nuôi cấy”Ngay cả ở các trường hợp âm tính khi soi kính hiển vi phết bệnh phẩm, tỷ lệ dương tính của nuôi cấy vẫn có thể đạt 42,7–47,1%1). Ngược lại, ở các trường hợp dương tính khi soi phết, tỷ lệ dương tính của nuôi cấy là 57,1–82,4%, và thực hiện đồng thời cả hai xét nghiệm sẽ làm tăng độ nhạy. Xét nghiệm PCR hữu ích như một phương tiện hỗ trợ cho soi phết và nuôi cấy, nhưng không khuyến nghị chẩn đoán viêm giác mạc do vi khuẩn chỉ bằng PCR1).
7. Nghiên cứu mới nhất và triển vọng tương lai
Phần tiêu đề “7. Nghiên cứu mới nhất và triển vọng tương lai”- Phân tích metagenome (giải trình tự thế hệ mới): đang dần có thể phân tích toàn diện hệ vi sinh trên bề mặt mắt, bao gồm cả các vi sinh vật không thể nuôi cấy. Kỳ vọng phát hiện được các tác nhân gây bệnh mà xét nghiệm nuôi cấy truyền thống không xác định được
- PCR đa mồi: đang phát triển các hệ thống có thể phát hiện nhanh đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, nấm, virus và Acanthamoeba) chỉ trong một lần xét nghiệm. Kỳ vọng cải thiện độ chính xác và tốc độ chẩn đoán viêm giác mạc nhiễm trùng3)
- Khối phổ MALDI-TOF: kỹ thuật khối phổ có thể định danh vi khuẩn nuôi cấy chỉ trong vài phút. So với các phương pháp định danh sinh hóa truyền thống, có thể rút ngắn thời gian đáng kể, và đang được nghiên cứu ứng dụng trong các bệnh nhiễm trùng mắt4)
- Tinh chỉnh độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm eosinophil: đang phát triển các phương pháp phát hiện eosinophil có độ nhạy cao bằng kính hiển vi điện tử và kháng thể đánh dấu huỳnh quang. Nhuộm Hansel truyền thống có giới hạn về độ nhạy phát hiện, và nếu thiết lập được phương pháp nhạy hơn, độ chính xác chẩn đoán có thể được cải thiện
8. Tài liệu tham khảo
Phần tiêu đề “8. Tài liệu tham khảo”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.