結膜刮片細胞學檢查與培養檢查（感染與過敏檢查）
1. 什麼是結膜刮片細胞學和培養檢查
Section titled “1. 什麼是結膜刮片細胞學和培養檢查”結膜刮片細胞學和微生物培養檢查，是用於辨識感染性眼病的致病菌、進行藥物敏感性試驗，以及確認過敏性結膜疾病中的嗜酸性粒細胞（明確診斷）的檢查。及早確定致病菌並選擇有效的抗菌藥物，可改善感染表現。
《感染性角膜炎診療指南（第3版）》強烈建議在懷疑感染性角膜炎時進行塗片鏡檢和培養檢查（證據強度C）1)。尤其在緊急性角膜炎、眼內炎，或懷疑有特殊致病菌的病例中，這是必需檢查。
《過敏性結膜疾病診療指南（第3版）》明確指出，嗜酸性粒細胞檢查（Hansel染色）是明確診斷的依據，也是將臨床診斷提升為明確診斷不可或缺的檢查2)。
懷疑感染性疾病時
Section titled “懷疑感染性疾病時”- 細菌性角膜炎與結膜炎（尤其屬於急症）
- 淋病性結膜炎（因可能導致角膜穿孔，早期診斷很重要）
- 棘阿米巴角膜炎（一般機構難以培養，建議進行鏡檢）
- 真菌性角膜炎
- 懷疑特殊致病菌的病例（如難治性、治療抗拒性角膜炎等）
過敏性眼疾的確診
Section titled “過敏性眼疾的確診”- 過敏性結膜炎（以嗜酸性球檢查作確診）
- 春季角結膜炎（vernal keratoconjunctivitis: VKC）
- 異位性角結膜炎（atopic keratoconjunctivitis: AKC）
2. 檢體採取手法
Section titled “2. 檢體採取手法”原則上應從懷疑有致病菌存在的部位確實採取檢體。採取時機會大幅影響陽性率。抗菌藥投與前的培養陽性率為 77.3%，而投與後則降至 37.8% 1)。務必在使用抗菌藥之前先採取檢體。
- 麻醉：使用點眼麻醉。以不含防腐劑者為佳（以避免防腐劑對微生物的影響）
- 採取器具：Kimura 刮板或高爾夫刀（用於結膜與角膜刮取）。也可使用化學纖維棉棒
- 採取部位：刮取病灶與正常組織的交界處。因為發炎部位與正常角膜的交界處有細菌存在，所以該交界區最為適合
- 防止乾燥：使用棉棒採取時，先以無菌生理食鹽水將棉棒潤濕。乾燥會降低檢體品質
- 棉棒材質：使用化學纖維材質。天然材質可能影響微生物生長與檢查方法
- 有些病例的病灶非常脆弱。不要勉強刮取
- 有報告指出，以棉棒刮取病灶的培養陽性率約為 50%，而使用 23G 針時為 35% 1)
- 若取樣量少，請在檢驗室明確註明檢驗優先順序
最重要的是在投與抗生素之前採樣。投藥後，培養陽性率會從77.3%大幅下降至37.8%。採樣部位應選在病灶與正常組織的交界處，而不是炎症中心，應擦拭邊緣部位。為避免乾燥，棉棒應先以無菌生理食鹽水潤濕。採樣器具可使用化學纖維棉棒或 Kimura spatula、golf knife，並在點眼麻醉下進行。若病灶脆弱，不要勉強擦取。
3. 塗片・顯微鏡檢查（染色方法與判定）
Section titled “3. 塗片・顯微鏡檢查（染色方法與判定）”
將採集的檢體塗抹於載玻片上，染色後以光學顯微鏡觀察。塗片鏡檢陽性率據稱為58.1–73.7%1)。
標本製作步驟
Section titled “標本製作步驟”- 以酒精擦拭載玻片，並在背面用鑽石筆或麥克筆標出檢體塗抹區域
- 刮片器輕輕攤開，薄薄地塗抹。棉棒在檢體量少時可像蓋章一樣輕壓塗抹，量較多時可像滾動一樣塗抹
- 以甲醇或火焰固定
染色方法的選擇
Section titled “染色方法的選擇”依目的從5種染色方法中選擇。
- 姬姆薩染色（Diff-Quik™）：一種用於篩檢的多用途染色法，可用於包括感染性和非感染性原因在內的檢查。使用快速染色試劑盒（Diff-Quik™），約15秒即可獲得與傳統方法相當的染色效果。所有微生物都會染成藍色，但無法區分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性1)
- 革蘭氏染色：專用于細菌感染的染色法。可區分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，並能觀察細菌形態（球菌、桿菌）。使用 Faver G（日水製藥）可在約3分鐘內完成1)
- FungiFloraY®染色：一種芪基磺酸類螢光染劑。可特異性染色β結構多醣（幾丁質和纖維素），並靈敏檢出真菌（菌絲和酵母）以及棘阿米巴包囊。需要使用螢光顯微鏡觀察1)
- 免疫螢光法：可直接證明HSV（單純疱疹病毒）、VZV（水痘-帶狀疱疹病毒）等病毒抗原1)
- Hansel染色：用於檢測過敏性結膜疾病中嗜酸性球的專用染色法
- 400倍：用於確認發炎細胞的種類（中性球直徑約12～15 μm）。細菌感染時以中性球為主，病毒感染時以淋巴球為主
- 1000倍油鏡：用於觀察菌體（細菌直徑約1.0 μm）
依病原體分類的染色方法與特徵性所見
Section titled “依病原體分類的染色方法與特徵性所見”| 疑似病原體 | 建議染色法 | 特徵性所見 |
|---|---|---|
| 細菌（一般） | 革蘭染色 | 革蘭陽性/陰性的球菌和桿菌 |
| 淋菌 | Diff-Quik™ | 咖啡豆狀雙球菌；位於中性球內 |
| 真菌 | Fungiflora Y® | 菌絲和分生子（螢光） |
| 棘阿米巴 | Fungiflora Y® | 雙層囊腫（約10×10 μm） |
| 病毒（如 HSV） | 螢光抗體法 | 感染細胞的特異螢光 |
| 嗜酸性球（過敏） | 漢塞爾染色 | 即使只有 1 個嗜酸性球也算陽性 |
4. 培養檢查
Section titled “4. 培養檢查”在培養檢查中，將致病微生物在培養基上繁殖，從而可以進行鑑定和藥物敏感性試驗。培養陽性率因機構和條件而異，為 37.6～74.3% 1)。由於眼外部存在常駐菌，分離出的菌不一定就是致病菌。應結合鏡檢結果、眼部所見、藥物敏感性和治療效果綜合判斷。
主要培養基類型
Section titled “主要培養基類型”| 培養基 | 目標微生物 | 培養條件 |
|---|---|---|
| 血液瓊脂培地 | 一般細菌（可判定溶血性） | 37℃，好氧 |
| 巧克力瓊脂培地 | Haemophilus屬、淋菌（含V因子、X因子） | 37℃，CO2 |
| 沙氏/馬鈴薯葡萄糖培地 | 真菌 | 在37℃與室溫兩種條件下培養 |
| 1.5% NN瓊脂平板 | 棘阿米巴 | 30℃ |
| 運送培地（Seed Swab®、Transwab®等） | 常見細菌（施設沒有固體培地時） | 常溫運送（陽性率50〜69%）1) |
當送到檢驗機構需要時間時，檢體的保存方式會因致病菌種類而異。
- 常見細菌：4°C（冰箱）保存
- 淋病雙球菌、腦膜炎雙球菌：對低溫敏感，容易死亡，因此以常溫保存
- 懷疑偏性厭氧菌時：放入厭氧運送器中保存
檢查申請要點
Section titled “檢查申請要點”- 在申請單上明確寫明臨床所見與目標微生物。加入選擇性培地可提高檢出率
- 如果採檢量少，請註明檢驗優先順序（例如：培養>鏡檢，細菌>真菌）
藥物感受性試驗的解讀
Section titled “藥物感受性試驗的解讀”在藥物敏感性試驗中，通常會從判定為S（敏感）的藥物裡選擇MIC（最小抑菌濃度）較低的藥物。不過，即使判定為R（抗藥），臨床上也可能有效，因此需要綜合評估。請注意，真菌與棘阿米巴的藥物敏感性試驗尚未建立判定標準1)。
培養陽性率為37.6–74.3%，即使陰性也不能排除感染。影響最大的因素是檢體採集時機；在使用抗菌藥後採集時，陽性率約減半。另外，抹片陰性病例的培養陽性率為42.7–47.1%，抹片陽性病例為57.1–82.4%，因此合併這兩項檢查可提高診斷準確性。由於棘阿米巴在一般機構中難以分離培養，應優先採用Diff-Quik™染色的鏡檢來確認包囊的雙層壁結構。
5. 嗜酸性球檢查（過敏性結膜疾病的確診）
Section titled “5. 嗜酸性球檢查（過敏性結膜疾病的確診）”
過敏性結膜疾病的確診需要在漢塞爾染色的結膜刮片塗片中檢出嗜酸性球2)。
- 點眼麻醉後，將上眼瞼翻轉
- 用玻璃棒輕輕按摩瞼結膜，並用鑷子或刮片採集聚集在結膜表面的黏液
- 塗抹於載玻片上，進行漢塞爾染色，並在光學顯微鏡下觀察
只要在顯微鏡下能看到哪怕1個嗜酸性球，即判定為陽性，並可作為過敏性結膜疾病的確診2)。若採樣時有出血，可能混入血液中的嗜酸性球，因此應在另一眼重新檢查。
過敏性結膜疾病的診斷架構
Section titled “過敏性結膜疾病的診斷架構”依據《過敏性結膜疾病診療指引（第3版）》的三階段診斷如下2)。
| 診斷分類 | 必要條件 |
|---|---|
| 臨床診斷 | 僅臨床所見（過敏性症狀與所見） |
| 臨床確診 | 臨床所見＋確認過敏體質（淚液總IgE陽性、皮膚測試、血清抗原特異性IgE陽性） |
| 確診 | 臨床所見＋嗜酸性球檢查陽性（確認眼局部過敏反應） |
臨床確診只確認全身性的過敏體質，並不能直接證明眼局部的過敏反應。只有在嗜酸性球檢查直接證明眼局部過敏反應時，才是確診2)。
6. 檢查結果的解讀與綜合判斷
Section titled “6. 檢查結果的解讀與綜合判斷”根據發炎細胞的種類推測病原體
Section titled “根據發炎細胞的種類推測病原體”即使沒有發現菌體，發炎細胞的種類也可作為推測病原體的線索。
- 嗜中性球為主 → 提示細菌感染
- 淋巴球為主 → 提示病毒感染
- 嗜酸性球為主 → 提示過敏性或寄生蟲感染
致病菌的綜合判斷
Section titled “致病菌的綜合判斷”分離出的菌是否為致病菌，需要綜合判斷。
- 鏡檢結果與培養分離菌的一致性（鏡檢中看到的菌與培養中生長的菌是否一致）
- 與眼部所見的一致性（是否為從病灶部位採集的檢體）
- 藥物感受性試驗結果與實際治療效果的一致性
注意特殊病原體
Section titled “注意特殊病原體”- 淋球菌：對乾燥與溫度變化很脆弱，容易死亡。採集後必須立即處理。不適合冷藏保存（應於室溫保存）
- 棘阿米巴：在一般機構中很難分離培養。使用 Dif-Quik™ 染色時，應優先確認具有雙層壁的囊體
塗片鏡檢與培養檢查的組合
Section titled “塗片鏡檢與培養檢查的組合”即使塗片鏡檢為陰性的病例，培養陽性率也可達42.7～47.1%1)。另一方面，塗片鏡檢陽性的病例培養陽性率為57.1～82.4%，同時進行兩項檢查可提高敏感度。PCR檢查可作為塗片鏡檢與培養檢查的輔助，但不建議僅靠PCR診斷細菌性角膜炎1)。
7. 最新研究與未來展望
Section titled “7. 最新研究與未來展望”- 宏基因組分析（次世代定序）：正逐步能夠對眼表微生物群進行全面解析，包括無法培養的微生物。可望偵測出傳統培養檢查無法辨識的病原體
- 多重 PCR：正在開發可在一次檢查中同時快速偵測多種病原體（細菌、真菌、病毒與棘阿米巴）的系統。可望提升感染性角膜炎的診斷準確度與速度3)
- MALDI-TOF 質譜法：一種可在短短幾分鐘內鑑定培養菌的質譜技術。與傳統生化鑑定法相比，可大幅縮短時間，正在研究其在眼科感染上的應用4)
- 嗜酸性球檢查的敏感度與特異度精細化：正在開發利用電子顯微鏡與螢光標記抗體的高敏感度嗜酸性球檢測方法。傳統的 Hansel 染色在檢測敏感度上有其限制，若能建立更高敏感度的檢測方法，診斷準確度有望提升
8. 參考文獻
Section titled “8. 參考文獻”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.