فحص الخلايا وزراعة ملتحمة العين (فحص العدوى والحساسية)
1. ما هي الخلايا المجهرية والزرع من كشط الملتحمة
Section titled “1. ما هي الخلايا المجهرية والزرع من كشط الملتحمة”الخلايا المجهرية وزرع الأحياء الدقيقة من كشط الملتحمة هما فحصان يُستخدمان لتحديد الميكروب المسبب في أمراض العين المعدية، وإجراء اختبار حساسية الأدوية، وتأكيد وجود الحمضات في مرض الملتحمة التحسسي (التشخيص النهائي). ومن خلال تحديد الميكروب المسبب مبكرًا واختيار مضاد حيوي فعال، يمكن توقع تحسن علامات العدوى.
توصي إرشادات تشخيص وعلاج التهاب القرنية المعدي (الطبعة الثالثة) بشدة بإجراء الفحص المجهري للمسحة والزرع عند الاشتباه بالتهاب القرنية المعدي (مستوى الدليل: C)1). وتُعد هذه الفحوصات أساسية، خاصة في حالات التهاب القرنية العاجلة أو التهاب باطن العين، أو عند الاشتباه بوجود ميكروب مسبب غير مألوف.
في إرشادات تشخيص وعلاج مرض الملتحمة التحسسي (الطبعة الثالثة)، يُذكر فحص الحمضات (صبغة هانسل) بوضوح كأساس للتشخيص النهائي، وهو فحص لا غنى عنه للانتقال من التشخيص السريري إلى التشخيص النهائي2).
الاستطبابات
Section titled “الاستطبابات”عند الاشتباه بمرض إنتاني
Section titled “عند الاشتباه بمرض إنتاني”- التهاب القرنية والملتحمة الجرثومي (وخاصةً إذا كان عاجلًا)
- التهاب الملتحمة بالمكورات البنية (التشخيص المبكر مهم لأنه قد يؤدي إلى انثقاب القرنية)
- التهاب القرنية بالأكانثاميبا (يصعب زرعه في المراكز العامة، لذا يُنصح بالفحص المجهري)
- التهاب القرنية الفطري
- حالات يُشتبه فيها بمُمرض سببي خاص (مثل التهاب القرنية المستعصي أو المقاوم للعلاج)
التشخيص المؤكد لأمراض العين التحسسية
Section titled “التشخيص المؤكد لأمراض العين التحسسية”- التهاب الملتحمة التحسسي (التشخيص المؤكد عبر فحص الحمضات)
- التهاب القرنية والملتحمة الربيعي (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- التهاب القرنية والملتحمة التأتبي (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
يُجرى أساسًا لهدفين. الأول عند الاشتباه في التهاب القرنية أو التهاب الملتحمة المعدي؛ وهو فحص ضروري خصوصًا في العدوى العاجلة مثل التهاب القرنية والتهاب باطن المقلة، أو عندما يُشتبه في كائنات ممرضة خاصة مثل المكورات البنية أو الأكانثاميبا أو الفطريات. والثاني لتأكيد مرض الملتحمة التحسسي؛ فإذا تم العثور على حتى خلية حمضية واحدة بصبغة Hansel، يثبت التشخيص. ولا تسمح العلامات السريرية وحدها إلا بتشخيص سريري، لذلك يُجرى فحص الحمضات عندما تكون هناك حاجة إلى تشخيص نهائي.
2. طريقة أخذ العينة
Section titled “2. طريقة أخذ العينة”المبدأ هو أخذ العينة جيدًا من الموضع الذي يُشتبه بوجود العامل الممرض فيه. يؤثر توقيت أخذ العينة كثيرًا في معدل الإيجابية. تبلغ نسبة إيجابية الزرع قبل إعطاء المضادات الحيوية 77.3%، بينما تنخفض بعد العلاج إلى 37.8% 1). يجب أخذ العينة قبل إعطاء المضادات الحيوية.
التحضير والخطوات
Section titled “التحضير والخطوات”- التخدير: يُستخدم تخدير على شكل قطرات للعين. ويفضل أن يكون خاليًا من المواد الحافظة (لتجنب تأثير المواد الحافظة على الكائنات الدقيقة)
- أداة أخذ العينة: ملعقة كيمورا أو سكين الغولف (لكشط الملتحمة والقرنية). أو مسحة من ألياف صناعية
- موضع أخذ العينة: تُكشط المنطقة الحدية بين الآفة والنسيج الطبيعي. لأن الجراثيم توجد عند الحد بين المنطقة الملتهبة والقرنية الطبيعية، فإن تلك المنطقة الحدية هي الأنسب
- منع الجفاف: عند أخذ العينة بالمسحة، تُبلل المسحة مسبقًا بمحلول ملحي معقم. يؤدي الجفاف إلى انخفاض جودة العينة
- مادة المسحة: استخدم مسحات من ألياف صناعية. قد تؤثر المواد الطبيعية في نمو الكائنات الدقيقة وفي طريقة الفحص
احتياطات
Section titled “احتياطات”- قد تكون الآفة شديدة الهشاشة في بعض الحالات. لا تكشطها بقوة
- أُبلغ أن معدل إيجابية الزرع لكشط الآفة بالمسحة يبلغ نحو 50%، وباستخدام إبرة 23G يبلغ 35% 1)
- إذا كانت كمية العينة قليلة، فاذكر أولوية الفحوصات للمختبر بوضوح
أهم نقطة هي أخذ العينة قبل إعطاء المضادات الحيوية. بعد إعطاء المضادات الحيوية تنخفض نسبة إيجابية الزرع بشكل كبير من 77.3% إلى 37.8%. يجب أن يكون موضع الأخذ في المنطقة الحدودية بين الآفة والنسيج السليم، أي كشط الحافة وليس مركز الالتهاب. تُرطَّب المسحة مسبقًا بمحلول ملحي معقم لمنع الجفاف. يمكن استخدام مسحة من الألياف الاصطناعية أو Kimura spatula أو golf knife، ويُجرى ذلك تحت تخدير موضعي. إذا كانت الآفة هشة، فلا تكشطها بقوة.
3. اللطاخة والفحص المجهري (طرق الصبغ والتفسير)
Section titled “3. اللطاخة والفحص المجهري (طرق الصبغ والتفسير)”
تُفرد العينة المأخوذة على شريحة زجاجية، ثم تُصبغ وتُفحص بالمجهر الضوئي. وتُذكر نسبة الإيجابية في الفحص اللطاخي والمجهري بأنها 58.1–73.7%1).
خطوات تحضير العينة
Section titled “خطوات تحضير العينة”- تُنظَّف الشريحة الزجاجية بالكحول، وتُحدَّد دائرة منطقة فرد العينة على الجهة الخلفية بقلم ماسي أو قلم حبر
- تُفرد العينة بطبقة رقيقة مع نشرها برفق. أما المسحة القطنية، فإذا كانت كمية العينة قليلة فتُفرد بالضغط الخفيف كما لو كانت ختمًا، وإذا كانت الكمية كافية فتُفرد بالتدحرج
- تُثبَّت بالميثانول أو باللهب
اختيار طريقة الصبغ
Section titled “اختيار طريقة الصبغ”يُختار من بين خمسة أنواع من طرق التلوين حسب الغرض.
- صبغة جيمزا (Diff-Quik™): طريقة تلوين متعددة الأغراض تُستخدم للفحص الأولي، بما في ذلك الحالات المعدية وغير المعدية. باستخدام مجموعة التلوين السريع (Diff-Quik™)، يمكن الحصول على تلوين مماثل للطريقة التقليدية في نحو 15 ثانية. تصطبغ جميع الكائنات الدقيقة باللون الأزرق، لكن لا يمكن التمييز بين الموجبة الغرام والسالبة الغرام1)
- صبغة غرام: طريقة تلوين مخصصة للعدوى البكتيرية. تُمكّن من التمييز بين البكتيريا موجبة الغرام وسالبة الغرام، كما تُمكّن من فحص شكل البكتيريا (مكورات أو عصيات). باستخدام Faver G (Nissui Pharmaceutical) يمكن إكمالها في نحو 3 دقائق1)
- صبغة FungiFloraY®: صبغة فلورية من نوع حمض الستيلبين السلفوني. تصبغ على نحو انتقائي عديدات السكاريد ذات الروابط β (الكيتين والسليلوز) وتكشف الفطريات (الخيوط الفطرية والخمائر) وأكياس الأكانتاميبا بحساسية عالية. يلزم الفحص بالمجهر الفلوري1)
- التألق المناعي: يُظهر مباشرةً المستضدات الفيروسية مثل HSV (فيروس الهربس البسيط) وVZV (فيروس الحماق النطاقي)1)
- صبغة هانسل: صبغة خاصة تُستخدم لكشف الخلايا الحمضية في أمراض الملتحمة التحسسية
تكبير الفحص المجهري
Section titled “تكبير الفحص المجهري”- 400 مرة: يُستخدم لتحديد نوع الخلايا الالتهابية (يبلغ قطر العدلات نحو 12–15 ميكرومتر). في العدوى البكتيرية تسود العدلات، وفي العدوى الفيروسية تسود الخلايا اللمفاوية
- 1000 مرة مع عدسة الزيت: يُستخدم لملاحظة الكائنات الدقيقة (يبلغ قطر البكتيريا نحو 1.0 ميكرومتر)
طرق التلوين والسمات المميزة حسب العامل الممرض
Section titled “طرق التلوين والسمات المميزة حسب العامل الممرض”| العامل الممرض المشتبه به | صبغة موصى بها | السمات المميزة |
|---|---|---|
| البكتيريا (عامة) | صبغة غرام | مكورات وعصيات موجبة/سالبة الغرام |
| المكورات البنية | Diff-Quik™ | مكورات ثنائية بشكل حبة البن؛ داخل العدلات |
| الفطريات | Fungiflora Y® | خيوط فطرية وأبواغ كونيدية (فلورية) |
| أكانثاميبا | Fungiflora Y® | أكياس ثنائية الجدار (حوالي 10×10 ميكرومتر) |
| الفيروسات (مثل HSV) | طريقة الأجسام المضادة الفلورية | فلورية نوعية في الخلايا المصابة |
| الحمضات (الحساسية) | صبغة هانسل | إيجابي حتى بوجود خلية حمضية واحدة |
4. الفحص بالزرع
Section titled “4. الفحص بالزرع”في فحص الزرع، يُنمّى الكائن الدقيق المسبب على أوساط الزرع، مما يتيح التعرف عليه واختبار حساسيته للأدوية. تتراوح نسبة الزرع الإيجابي بحسب المنشأة والظروف بين 37.6 و74.3% 1). وبما أن العين الخارجية تحتوي على فلورا طبيعية، فالكائن المعزول ليس بالضرورة هو المسبب. يُحكم بصورة شاملة بناءً على نتائج الفحص المجهري، ونتائج العين، وحساسية الأدوية، واستجابة العلاج.
الأنواع الرئيسية لأوساط الزرع
Section titled “الأنواع الرئيسية لأوساط الزرع”| وسط زرع | الكائن الدقيق المستهدف | شروط الزرع |
|---|---|---|
| وسط أجار الدم | البكتيريا الشائعة (يمكن تقييم الانحلال الدموي) | 37°م، هوائي |
| وسط أجار الشوكولاتة | المستدمية (Haemophilus) والمكورات البنية (يحتوي على العاملين V وX) | 37°م، CO2 |
| وسط سابورو/بطاطس ديكستروز | الفطريات | يُزرع تحت شرطين: 37°م ودرجة حرارة الغرفة |
| طبق أجار NN بنسبة 1.5% | أكانثاميبا | 30°م |
| وسط نقل (Seed Swab®، Transwab®، إلخ) | الجراثيم الشائعة (عندما لا يتوفر وسط صلب في المنشأة) | النقل بدرجة حرارة الغرفة (معدل الإيجابية 50–69%)1) |
حفظ العينة
Section titled “حفظ العينة”تختلف طريقة حفظ العينة عندما يستغرق نقلها إلى المختبر وقتًا طويلًا حسب نوع الميكروب المسبب.
- الجراثيم الشائعة: تُحفظ عند 4 درجات مئوية (في الثلاجة)
- المكورات البنية والمكورات السحائية: تُحفظ في درجة حرارة الغرفة لأنها حساسة للبرودة وسريعة الموت
- إذا كان يُشتبه في الجراثيم اللاهوائية الإجبارية: تُحفظ في وعاء نقل لاهوائي
نقاط مهمة عند طلب الفحص
Section titled “نقاط مهمة عند طلب الفحص”- اكتب بوضوح الموجودات السريرية والكائن الدقيق المستهدف في استمارة الطلب. إضافة أوساط انتقائية تُحسن معدل الكشف
- إذا كانت كمية العينة قليلة، فاذكر أولوية الفحوص (مثلًا: الزرع > الفحص المجهري، الجراثيم > الفطريات)
تفسير اختبار حساسية الأدوية
Section titled “تفسير اختبار حساسية الأدوية”في اختبار الحساسية الدوائية، غالبًا ما يُختار الدواء ذو MIC (التركيز الأدنى المثبط للنمو) الأقل من بين الأدوية المصنفة S (حسّاس). ومع ذلك، حتى إذا صُنِّف الدواء R (مقاومًا)، فقد يكون فعالًا سريريًا، لذا يلزم تقييم شامل. ويُرجى ملاحظة أنه لم تُوضع معايير تفسير لاختبار الحساسية الدوائية للفطريات والأكانثاميبا 1).
تتراوح نسبة إيجابية الزرع بين 37.6 و74.3%، ولا يستبعد التشخيص العدوى حتى إذا كانت النتيجة سلبية. أهم عامل مؤثر هو توقيت أخذ العينة؛ فعند أخذها بعد إعطاء المضادات الحيوية تنخفض نسبة الإيجابية إلى نحو النصف. كما أن نسبة إيجابية الزرع في الحالات السلبية في اللطاخة هي 42.7–47.1%، وفي الحالات الإيجابية في اللطاخة 57.1–82.4%، لذلك فإن الجمع بين الاختبارين يحسن دقة التشخيص. ولأن الأكانثاميبا يصعب عزلها وزراعتها في المرافق العامة، فيُفضَّل الفحص المجهري بصبغة Diff-Quik™ للتأكد من البنية ثنائية الجدار للكيسة.
5. فحص الحمضات (التشخيص المؤكد لمرض الملتحمة التحسسي)
Section titled “5. فحص الحمضات (التشخيص المؤكد لمرض الملتحمة التحسسي)”
للتشخيص المؤكد لمرض الملتحمة التحسسي، يجب كشف الحمضات في لطاخة كشط من الملتحمة مصبوغة بصبغة هانسل 2).
طريقة أخذ العينة
Section titled “طريقة أخذ العينة”- بعد التخدير الموضعي، تُقلب الجفنة العلوية
- تُدلَّك ملتحمة الجفن برفق بقضيب زجاجي، وتُجمع المخاط المتراكم على سطح الملتحمة بملقط أو سباتولا
- تُفرد على شريحة، ثم تُجرى صبغة هانسل، وتُفحص بالمجهر الضوئي
التفسير
Section titled “التفسير”إذا أمكن رؤية حتى خلية حمضات واحدة تحت المجهر، فيُحكم على النتيجة بأنها إيجابية، ويكون ذلك تشخيصًا نهائيًا لمرض الملتحمة التحسسي2). إذا لوحظ نزف أثناء أخذ العينة، فقد تختلط حمضات من الدم بالعينة، لذلك يُجرى الفحص مرة أخرى في العين الأخرى.
نظام تشخيص مرض الملتحمة التحسسي
Section titled “نظام تشخيص مرض الملتحمة التحسسي”استنادًا إلى الدليل الإرشادي لعلاج مرض الملتحمة التحسسي (الطبعة الثالثة)، تكون المراحل الثلاث للتشخيص كما يلي2).
| فئة التشخيص | الشروط المطلوبة |
|---|---|
| التشخيص السريري | الموجودات السريرية فقط (أعراض وعلامات تحسسية) |
| التشخيص السريري النهائي | الموجودات السريرية + تأكيد الاستعداد التحسسي (إيجابية IgE الكلي في الدمع، اختبار الجلد، إيجابية IgE النوعية للمستضد في المصل) |
| التشخيص النهائي | الموجودات السريرية + إيجابية اختبار الحمضات (تأكيد تفاعل تحسسي موضعي في العين) |
يقتصر التشخيص السريري النهائي على تأكيد الاستعداد التحسسي العام، ولا يثبت مباشرةً وجود تفاعل تحسسي في العين نفسها. ولا يُعد التشخيص نهائيًا إلا عندما يثبت اختبار الحمضات مباشرةً وجود تفاعل تحسسي موضعي في العين2).
6. تفسير نتائج الفحص والحكم الشامل
Section titled “6. تفسير نتائج الفحص والحكم الشامل”الاستدلال على العامل الممرض بحسب نوع الخلايا الالتهابية
Section titled “الاستدلال على العامل الممرض بحسب نوع الخلايا الالتهابية”حتى إذا لم تُعثر على الجراثيم، فإن نوع الخلايا الالتهابية قد يكون دليلاً على العامل الممرض المحتمل.
- غلبة العدلات → تشير إلى عدوى بكتيرية
- غلبة الخلايا اللمفاوية → تشير إلى عدوى فيروسية
- غلبة الحمضات → تشير إلى عدوى تحسسية أو طفيلية
الحكم الشامل على الجرثومة المسببة
Section titled “الحكم الشامل على الجرثومة المسببة”يُحكم على ما إذا كانت الجرثومة المعزولة هي الجرثومة المسببة بشكل شامل.
- التوافق بين نتائج الفحص المجهري والجرثومة المعزولة في الزرع (هل الجرثومة التي شوهدت بالمجهر هي نفسها التي نمت في الزرع)
- التوافق مع الموجودات العينية (هل كانت العينة مأخوذة من موضع الآفة)
- التوافق بين نتائج اختبار حساسية الأدوية والتأثير العلاجي الفعلي
الانتباه إلى العوامل الممرضة الخاصة
Section titled “الانتباه إلى العوامل الممرضة الخاصة”- المكورات البنية: تكون حساسة للجفاف وتغيرات الحرارة وتموت بسهولة. المعالجة فورًا بعد أخذ العينة ضرورية. التخزين المبرد غير مناسب (يُحفظ في درجة حرارة الغرفة)
- الأكانثاميبا: من الصعب عزلها وزراعتها في المرافق العامة. في صبغة Dif-Quik™ ينبغي إعطاء الأولوية للتأكد من الأكياس ذات الجدار المزدوج
الدمج بين الفحص المجهري للمسحة وزراعة العينة
Section titled “الدمج بين الفحص المجهري للمسحة وزراعة العينة”حتى في الحالات السلبية في الفحص المجهري للمسحة، قد تصل نسبة إيجابية الزراعة إلى 42.7–47.1%1). ومن ناحية أخرى، تبلغ نسبة إيجابية الزراعة في الحالات الإيجابية للمسحة 57.1–82.4%، وإجراء الفحصين معًا يزيد الحساسية. يفيد فحص PCR كأداة مساعدة للفحص المجهري للمسحة وزراعة العينة، لكن لا يُنصح بتشخيص التهاب القرنية الجرثومي اعتمادًا على PCR وحده1).
7. أحدث الأبحاث وآفاق المستقبل
Section titled “7. أحدث الأبحاث وآفاق المستقبل”- التحليل الميتاجينومي (التسلسل الجيني من الجيل التالي): أصبح من الممكن تدريجيًا التحليل الشامل للميكروبيوم على سطح العين، بما في ذلك الكائنات الدقيقة التي لا يمكن زرعها. ومن المتوقع كشف مسببات المرض التي لا يمكن تحديدها بالفحوصات الزرعية التقليدية
- PCR متعدد الأهداف: يتقدم تطوير أنظمة يمكنها الكشف السريع والمتزامن عن عدة مسببات مرضية (بكتيريا وفطريات وفيروسات وأكانثاميبا) في فحص واحد. ومن المتوقع تحسين دقة تشخيص التهاب القرنية الإنتاني وسرعته3)
- مطيافية الكتلة MALDI-TOF: تقنية مطيافية كتلة يمكنها تحديد البكتيريا المزروعة خلال بضع دقائق فقط. وبالمقارنة مع طرق التعريف الكيميائية الحيوية التقليدية، يمكن تقليل الوقت بشكل كبير، ويجري البحث في تطبيقها على التهابات العين4)
- تحسين حساسية ونوعية اختبار الخلايا الحمضية: يتقدم تطوير طرق عالية الحساسية للكشف عن الخلايا الحمضية باستخدام المجهر الإلكتروني والأجسام المضادة الموسومة فلوريًا. وتوجد حدود لحساسية الكشف في صبغة Hansel التقليدية، وإذا أمكن إرساء طريقة أكثر حساسية فقد تتحسن الدقة التشخيصية
8. المراجع
Section titled “8. المراجع”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.