Sitologi dan kultur konjungtiva (pemeriksaan infeksi dan alergi)
1. Apa itu sitologi dan kultur kerokan konjungtiva
Section titled “1. Apa itu sitologi dan kultur kerokan konjungtiva”Sitologi kerokan konjungtiva dan kultur mikroba adalah pemeriksaan untuk mengidentifikasi kuman penyebab pada penyakit mata infeksi, melakukan uji kepekaan obat, dan memastikan eosinofil pada penyakit konjungtiva alergi (diagnosis pasti). Dengan mengidentifikasi kuman penyebab lebih awal dan memilih antibiotik yang efektif, perbaikan tanda infeksi dapat diharapkan.
Pedoman Diagnosis dan Tata Laksana Keratitis Infeksi (edisi ke-3) sangat merekomendasikan pemeriksaan apus mikroskopis dan kultur bila dicurigai keratitis infeksi (tingkat bukti: C)1). Pemeriksaan ini dianggap penting, terutama pada kasus keratitis atau endoftalmitis yang membutuhkan penanganan segera, atau bila diduga ada kuman penyebab yang tidak biasa.
Dalam Pedoman Diagnosis dan Tata Laksana Penyakit Konjungtiva Alergi (edisi ke-3), pemeriksaan eosinofil (pewarnaan Hansel) disebut jelas sebagai dasar diagnosis pasti, dan merupakan pemeriksaan yang tidak dapat diabaikan untuk menaikkan diagnosis klinis menjadi diagnosis pasti2).
Indikasi
Section titled “Indikasi”Bila dicurigai penyakit infeksi
Section titled “Bila dicurigai penyakit infeksi”- Keratitis dan konjungtivitis bakterial (terutama yang bersifat gawat darurat)
- Konjungtivitis gonokokal (diagnosis dini penting karena dapat menyebabkan perforasi kornea)
- Keratitis Acanthamoeba (kultur sulit dilakukan di fasilitas umum, sehingga pemeriksaan mikroskopik dianjurkan)
- Keratitis jamur
- Kasus yang dicurigai disebabkan oleh kuman penyebab khusus (misalnya keratitis yang sulit sembuh atau resisten terhadap terapi)
Diagnosis pasti penyakit mata alergi
Section titled “Diagnosis pasti penyakit mata alergi”- Konjungtivitis alergi (diagnosis pasti melalui pemeriksaan eosinofil)
- Keratokonjungtivitis vernal (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Keratokonjungtivitis atopik (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Dilakukan terutama untuk dua tujuan. Pertama, bila dicurigai keratitis infeksi atau konjungtivitis; ini merupakan pemeriksaan yang penting, terutama pada infeksi gawat seperti keratitis dan endoftalmitis, atau bila dicurigai kuman penyebab khusus seperti gonokokus, Acanthamoeba, atau jamur. Kedua, untuk memastikan diagnosis penyakit konjungtiva alergi; jika satu eosinofil saja ditemukan dengan pewarnaan Hansel, diagnosis pasti dapat ditegakkan. Temuan klinis saja hanya memberi diagnosis klinis, sehingga pemeriksaan eosinofil dilakukan bila diagnosis pasti diperlukan.
2. Teknik pengambilan sampel
Section titled “2. Teknik pengambilan sampel”Prinsipnya adalah mengambil sampel dengan baik dari daerah yang dicurigai tempat kuman penyebab berada. Waktu pengambilan sangat memengaruhi angka positif. Angka positif kultur sebelum pemberian antibiotik adalah 77,3%, sedangkan setelah pemberian antibiotik turun menjadi 37,8% 1). Pastikan sampel diambil sebelum antibiotik diberikan.
Persiapan dan langkah
Section titled “Persiapan dan langkah”- Anestesi: Gunakan anestesi tetes mata. Sediaan bebas pengawet lebih disukai (untuk menghindari pengaruh pengawet terhadap mikroorganisme)
- Alat pengambilan: spatula Kimura atau pisau golf (untuk mengerok konjungtiva dan kornea). Atau swab serat sintetis
- Lokasi pengambilan: kerok area batas antara lesi dan jaringan normal. Karena kuman berada di batas antara area yang meradang dan kornea normal, area batas tersebut paling sesuai
- Pencegahan kekeringan: saat mengambil dengan swab, basahi swab terlebih dahulu dengan larutan saline steril. Kekeringan menurunkan mutu sampel
- Bahan swab: gunakan bahan serat sintetis. Bahan alami dapat memengaruhi pertumbuhan mikroorganisme dan metode pemeriksaan
Hal yang perlu diperhatikan
Section titled “Hal yang perlu diperhatikan”- Pada beberapa kasus, lesi sangat rapuh. Jangan mengerok dengan paksa
- Dilaporkan bahwa angka positif kultur untuk pengerokan lesi dengan swab sekitar 50%, dan 35% dengan jarum 23G 1)
- Jika jumlah sampel sedikit, cantumkan dengan jelas prioritas pemeriksaan kepada laboratorium
Hal terpenting adalah mengambil sampel sebelum pemberian antibiotik. Setelah antibiotik diberikan, tingkat positif kultur turun jauh dari 77,3% menjadi 37,8%. Lokasi pengambilan adalah zona perbatasan antara lesi dan jaringan normal; kerok bagian tepinya, bukan pusat peradangan. Basahi swab terlebih dahulu dengan larutan garam steril agar tidak kering. Gunakan swab serat sintetis atau Kimura spatula atau golf knife, dan lakukan di bawah anestesi tetes mata. Jika lesinya rapuh, jangan dikerok dengan paksa.
3. Sediaan apus dan pemeriksaan mikroskopis (metode pewarnaan dan penilaian)
Section titled “3. Sediaan apus dan pemeriksaan mikroskopis (metode pewarnaan dan penilaian)”
Sampel yang diambil dioleskan pada kaca objek, diwarnai, lalu diamati dengan mikroskop cahaya. Angka positif pemeriksaan apus dan mikroskopis dilaporkan sebesar 58,1–73,7%1).
Langkah pembuatan sediaan
Section titled “Langkah pembuatan sediaan”- Bersihkan kaca objek dengan alkohol, lalu tandai area olesan sampel di bagian belakang dengan pensil berlian atau spidol
- Oleskan bahan secara tipis dengan meratakannya perlahan. Untuk swab, jika jumlah sampel sedikit, oleskan dengan menekan ringan seperti memberi cap; jika jumlahnya cukup, oleskan dengan cara digulung
- Fiksasi dengan metil alkohol atau api
Pemilihan metode pewarnaan
Section titled “Pemilihan metode pewarnaan”Pilih dari lima metode pewarnaan sesuai tujuan.
- Pewarnaan Giemsa (Diff-Quik™): metode pewarnaan serbaguna yang digunakan untuk skrining, termasuk penyebab infeksi dan noninfeksi. Dengan kit pewarnaan cepat (Diff-Quik™), hasil pewarnaan yang setara dengan metode konvensional dapat diperoleh dalam waktu sekitar 15 detik. Semua mikroorganisme akan tampak biru, tetapi bakteri Gram-positif dan Gram-negatif tidak dapat dibedakan1)
- Pewarnaan Gram: metode pewarnaan yang khusus untuk infeksi bakteri. Metode ini dapat membedakan bakteri Gram-positif dan Gram-negatif serta menilai bentuk bakteri (kokus atau basil). Dengan Faver G (Nissui Pharmaceutical), prosedur ini dapat selesai dalam sekitar 3 menit1)
- Pewarnaan FungiFloraY®: pewarna fluoresen jenis asam stilbena sulfonat. Pewarna ini secara selektif mewarnai polisakarida berikatan β (kitin dan selulosa) dan secara sensitif mendeteksi jamur (hifa dan ragi) serta kista Acanthamoeba. Pengamatan dengan mikroskop fluoresensi diperlukan1)
- Imunofluoresensi: secara langsung membuktikan antigen virus seperti HSV (virus herpes simpleks) dan VZV (virus varisela-zoster)1)
- Pewarnaan Hansel: pewarna khusus yang digunakan untuk mendeteksi eosinofil pada penyakit konjungtiva alergi
Pembesaran mikroskopis
Section titled “Pembesaran mikroskopis”- 400x: digunakan untuk memastikan jenis sel inflamasi (diameter neutrofil sekitar 12-15 μm). Pada infeksi bakteri, neutrofil lebih dominan; pada infeksi virus, limfosit lebih dominan
- 1000x imersi minyak: digunakan untuk mengamati mikroorganisme (diameter bakteri sekitar 1,0 μm)
Metode pewarnaan dan temuan khas menurut patogen
Section titled “Metode pewarnaan dan temuan khas menurut patogen”| Patogen yang dicurigai | Pewarnaan yang direkomendasikan | Temuan khas |
|---|---|---|
| Bakteri (umum) | Pewarnaan Gram | Kokus dan basil Gram-positif/Gram-negatif |
| Gonokokus | Diff-Quik™ | Diplokokus berbentuk biji kopi; di dalam neutrofil |
| Jamur | Fungiflora Y® | Hifa dan konidia (fluoresen) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Kista berdinding ganda (sekitar 10×10 μm) |
| Virus (seperti HSV) | Metode antibodi fluoresen | Fluoresensi khas pada sel yang terinfeksi |
| Eosinofil (alergi) | Pewarnaan Hansel | Positif bahkan jika hanya ada 1 eosinofil |
4. Pemeriksaan kultur
Section titled “4. Pemeriksaan kultur”Pada pemeriksaan kultur, mikroorganisme penyebab ditumbuhkan pada media kultur sehingga dapat dilakukan identifikasi dan uji kepekaan obat. Angka kultur positif bervariasi menurut fasilitas dan kondisi, yaitu 37,6–74,3% 1). Karena pada permukaan luar mata terdapat flora normal, kuman yang diisolasi belum tentu menjadi penyebab. Penilaian dilakukan secara menyeluruh berdasarkan hasil mikroskopi, temuan mata, kepekaan obat, dan respons terapi.
Jenis utama media kultur
Section titled “Jenis utama media kultur”| Media kultur | Mikroorganisme target | Kondisi kultur |
|---|---|---|
| media agar darah | bakteri umum (dapat menilai hemolisis) | 37°C, aerob |
| media agar cokelat | Haemophilus dan gonokokus (mengandung faktor V dan X) | 37°C, CO2 |
| media Sabouraud/dextrose kentang | jamur | dikultur pada dua kondisi: 37°C dan suhu ruang |
| cawan agar NN 1,5% | Acanthamoeba | 30°C |
| Media transport (Seed Swab®, Transwab®, dll.) | Bakteri umum (jika fasilitas tidak memiliki media padat) | Transportasi suhu ruang (angka positif 50–69%)1) |
Penyimpanan spesimen
Section titled “Penyimpanan spesimen”Cara menyimpan spesimen saat butuh waktu untuk dikirim ke laboratorium berbeda-beda tergantung jenis kuman penyebabnya.
- Bakteri umum: Simpan pada 4°C (kulkas)
- Gonokokus dan meningokokus: Simpan pada suhu ruang karena sensitif terhadap suhu dingin dan mudah mati
- Jika dicurigai bakteri anaerob obligat: Simpan dalam wadah transport anaerob
Poin penting saat memesan pemeriksaan
Section titled “Poin penting saat memesan pemeriksaan”- Tuliskan temuan klinis dan mikroorganisme target dengan jelas pada formulir permintaan. Penambahan media selektif meningkatkan angka deteksi
- Jika jumlah sampel sedikit, cantumkan prioritas pemeriksaan (misalnya, kultur > mikroskopi, bakteri > jamur)
Interpretasi uji kepekaan obat
Section titled “Interpretasi uji kepekaan obat”Dalam uji kepekaan obat, biasanya dipilih obat dengan MIC (konsentrasi hambat minimum) yang lebih rendah di antara yang dinilai S (sensitif). Namun, meskipun dinilai R (resisten), obat tersebut kadang tetap efektif secara klinis, sehingga penilaian menyeluruh diperlukan. Perlu dicatat bahwa kriteria interpretasi untuk uji kepekaan obat pada jamur dan Acanthamoeba belum ditetapkan 1).
Tingkat kultur positif adalah 37.6–74.3%, dan hasil negatif tidak dapat menyingkirkan infeksi. Faktor yang paling berpengaruh adalah waktu pengambilan sampel; jika diambil setelah pemberian antibiotik, tingkat positifnya sekitar setengah. Selain itu, tingkat positif kultur pada kasus dengan apusan negatif adalah 42.7–47.1%, sedangkan pada kasus dengan apusan positif adalah 57.1–82.4%, sehingga menggabungkan kedua pemeriksaan meningkatkan akurasi diagnosis. Karena Acanthamoeba sulit diisolasi dan dikultur di fasilitas umum, pemeriksaan mikroskopis dengan pewarnaan Diff-Quik™ diprioritaskan untuk memastikan struktur dinding ganda kista.
5. Pemeriksaan eosinofil (diagnosis pasti penyakit konjungtiva alergi)
Section titled “5. Pemeriksaan eosinofil (diagnosis pasti penyakit konjungtiva alergi)”
Untuk diagnosis pasti penyakit konjungtiva alergi, eosinofil harus dideteksi pada apusan kerokan konjungtiva yang diwarnai Hansel 2).
Teknik pengambilan
Section titled “Teknik pengambilan”- Setelah anestesi topikal, balik kelopak mata atas
- Pijat ringan konjungtiva palpebra dengan batang kaca, lalu kumpulkan lendir yang terkumpul di permukaan konjungtiva dengan pinset atau spatula
- Oleskan pada kaca objek, lakukan pewarnaan Hansel, lalu amati dengan mikroskop cahaya
Penilaian
Section titled “Penilaian”Jika bahkan satu eosinofil dapat dilihat di bawah mikroskop, hasilnya dinilai positif dan menjadi diagnosis pasti penyakit konjungtiva alergi2). Jika saat pengambilan sampel terlihat perdarahan, eosinofil dari darah dapat ikut tercampur, sehingga pemeriksaan diulang pada mata yang satunya.
Sistem diagnosis penyakit konjungtiva alergi
Section titled “Sistem diagnosis penyakit konjungtiva alergi”Tiga tahap diagnosis berdasarkan Pedoman Praktik Klinis Penyakit Konjungtiva Alergi (edisi ke-3) adalah sebagai berikut2).
| Kategori diagnosis | Syarat yang diperlukan |
|---|---|
| Diagnosis klinis | Hanya temuan klinis (gejala dan tanda alergi) |
| Diagnosis klinis pasti | Temuan klinis + konfirmasi predisposisi alergi (IgE total dalam air mata positif, tes kulit, IgE serum spesifik terhadap antigen positif) |
| Diagnosis pasti | Temuan klinis + tes eosinofil positif (konfirmasi reaksi alergi lokal pada mata) |
Diagnosis klinis pasti hanya mengonfirmasi predisposisi alergi sistemik dan tidak secara langsung membuktikan reaksi alergi di mata. Diagnosis baru dianggap pasti jika tes eosinofil secara langsung membuktikan reaksi alergi lokal di mata2).
6. Interpretasi hasil pemeriksaan dan penilaian menyeluruh
Section titled “6. Interpretasi hasil pemeriksaan dan penilaian menyeluruh”Perkiraan patogen berdasarkan jenis sel radang
Section titled “Perkiraan patogen berdasarkan jenis sel radang”Meski tidak ditemukan jasad kuman, jenis sel radang dapat menjadi petunjuk untuk memperkirakan patogen.
- Dominasi neutrofil → mengarah ke infeksi bakteri
- Dominasi limfosit → mengarah ke infeksi virus
- Dominasi eosinofil → mengarah ke infeksi alergi atau parasit
Penilaian menyeluruh terhadap kuman penyebab
Section titled “Penilaian menyeluruh terhadap kuman penyebab”Apakah isolat merupakan kuman penyebab dinilai secara komprehensif.
- Kesesuaian antara hasil mikroskopi dan kuman yang diisolasi dari kultur (apakah kuman yang terlihat pada mikroskop sama dengan yang tumbuh dalam kultur)
- Kesesuaian dengan temuan okular (apakah sampel diambil dari lesi)
- Kesesuaian antara hasil uji sensitivitas obat dan efek terapi yang sebenarnya
Perhatian terhadap patogen khusus
Section titled “Perhatian terhadap patogen khusus”- Gonokokus: mudah rusak oleh kekeringan dan perubahan suhu, sehingga cepat mati. Pemrosesan segera setelah pengambilan sangat penting. Penyimpanan di lemari es tidak sesuai (simpan pada suhu ruang)
- Acanthamoeba: sulit diisolasi dan dikultur di fasilitas umum. Dengan pewarnaan Dif-Quik™, prioritas diberikan pada konfirmasi kista dengan dinding ganda
Kombinasi pemeriksaan mikroskopis sediaan apus dan kultur
Section titled “Kombinasi pemeriksaan mikroskopis sediaan apus dan kultur”Bahkan pada kasus dengan hasil mikroskopis sediaan apus negatif, angka positif kultur dapat mencapai 42,7–47,1%1). Sebaliknya, pada kasus dengan apus positif, angka positif kultur adalah 57,1–82,4%, dan melakukan kedua pemeriksaan secara bersamaan meningkatkan sensitivitas. Pemeriksaan PCR berguna sebagai pelengkap pemeriksaan mikroskopis sediaan apus dan kultur, tetapi tidak dianjurkan mendiagnosis keratitis bakterial hanya dengan PCR1).
7. Penelitian terbaru dan prospek masa depan
Section titled “7. Penelitian terbaru dan prospek masa depan”- Analisis metagenomik (sekuensing generasi berikutnya): analisis menyeluruh mikrobioma permukaan mata, termasuk mikroorganisme yang tidak dapat dikultur, semakin memungkinkan. Diharapkan dapat mendeteksi patogen yang tidak dapat diidentifikasi dengan pemeriksaan kultur konvensional
- PCR multiplex: pengembangan sistem yang dapat mendeteksi cepat beberapa patogen (bakteri, jamur, virus, dan Acanthamoeba) secara bersamaan dalam satu pemeriksaan sedang berlangsung. Diharapkan meningkatkan akurasi dan kecepatan diagnosis keratitis infeksius3)
- Spektrometri massa MALDI-TOF: teknik spektrometri massa yang dapat mengidentifikasi bakteri hasil kultur hanya dalam beberapa menit. Dibandingkan dengan metode identifikasi biokimia konvensional, waktu dapat dipersingkat secara signifikan, dan penerapannya pada infeksi mata sedang diteliti4)
- Penyempurnaan sensitivitas dan spesifisitas pemeriksaan eosinofil: pengembangan metode deteksi eosinofil dengan sensitivitas tinggi menggunakan mikroskop elektron dan antibodi berlabel fluoresen sedang berlangsung. Pewarnaan Hansel konvensional memiliki keterbatasan dalam sensitivitas deteksi, dan jika metode yang lebih sensitif berhasil ditetapkan, akurasi diagnosis dapat meningkat
8. Referensi
Section titled “8. Referensi”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.