Konjunktivale Zytologie und Kultur (Infektions- und Allergietests)
1. Was sind Zytologie und Kultur von Bindehautabschabungen
Abschnitt betitelt „1. Was sind Zytologie und Kultur von Bindehautabschabungen“Die Zytologie von Bindehautabschabungen und die mikrobielle Kultur sind Untersuchungen zur Identifizierung des Erregers bei infektiösen Augenerkrankungen, zur Durchführung von Arzneiempfindlichkeitstests und zum Nachweis von Eosinophilen bei allergischer Bindehauterkrankung (gesicherte Diagnose). Durch die frühe Identifizierung des Erregers und die Auswahl eines wirksamen Antibiotikums kann eine Besserung der Entzündungszeichen erwartet werden.
Die Leitlinie zur Diagnose und Behandlung der infektiösen Keratitis (3. Auflage) empfiehlt dringend, bei Verdacht auf infektiöse Keratitis eine mikroskopische Ausstrichuntersuchung und Kultur durchzuführen (Evidenzstärke: C)1). Dies gilt als unverzichtbare Untersuchung, insbesondere bei dringender Keratitis oder Endophthalmitis oder wenn ein ungewöhnlicher Erreger vermutet wird.
In der Leitlinie zur Diagnose und Behandlung allergischer Bindehauterkrankungen (3. Auflage) wird die Eosinophilenuntersuchung (Hansel-Färbung) ausdrücklich als Grundlage der gesicherten Diagnose genannt und ist eine unverzichtbare Untersuchung, um eine klinische Diagnose in eine gesicherte Diagnose zu überführen2).
Indikationen
Abschnitt betitelt „Indikationen“Wenn eine infektiöse Erkrankung vermutet wird
Abschnitt betitelt „Wenn eine infektiöse Erkrankung vermutet wird“- Bakterielle Keratitis und Konjunktivitis (insbesondere dringend)
- Gonokokkenkonjunktivitis (eine frühe Diagnose ist wichtig, da es zu einer Hornhautperforation kommen kann)
- Acanthamoeba-Keratitis (eine Kultur ist in allgemeinen Einrichtungen schwierig, daher wird eine mikroskopische Untersuchung empfohlen)
- Pilzkeratitis
- Fälle mit Verdacht auf besondere Erreger (z. B. therapierefraktäre oder behandlungsresistente Keratitis)
Gesicherte Diagnose allergischer Augenerkrankungen
Abschnitt betitelt „Gesicherte Diagnose allergischer Augenerkrankungen“- Allergische Konjunktivitis (gesicherte Diagnose durch Eosinophilenuntersuchung)
- Vernale Keratokonjunktivitis (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Atopische Keratokonjunktivitis (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Es wird hauptsächlich aus zwei Gründen durchgeführt. Erstens bei Verdacht auf infektiöse Keratitis oder Konjunktivitis; besonders bei dringenden Infektionen wie Keratitis und Endophthalmitis oder wenn spezielle Erreger wie Gonokokken, Acanthamoeba oder Pilze vermutet werden, ist es eine unverzichtbare Untersuchung. Zweitens dient es der Bestätigung einer allergischen Konjunktivalerkrankung; wenn mit der Hansel-Färbung auch nur ein Eosinophiler nachgewiesen wird, ist die Diagnose gesichert. Allein klinische Befunde erlauben nur eine klinische Diagnose, daher wird die Eosinophilen-Untersuchung durchgeführt, wenn eine sichere Diagnose benötigt wird.
2. Technik der Probenentnahme
Abschnitt betitelt „2. Technik der Probenentnahme“Grundsätzlich soll die Probe kräftig aus dem Bereich entnommen werden, in dem der Erreger vermutet wird. Der Zeitpunkt der Entnahme beeinflusst die Positivrate stark. Die Kultur-Positivrate vor Antibiotikagabe beträgt 77,3 %, während sie nach der Behandlung auf 37,8 % sinkt 1). Die Probe sollte daher unbedingt vor der Gabe von Antibiotika entnommen werden.
Vorbereitung und Vorgehen
Abschnitt betitelt „Vorbereitung und Vorgehen“- Anästhesie: Verwenden Sie eine betäubende Augentropfenlösung. Eine konservierungsmittelfreie Zubereitung ist vorzuziehen (um die Wirkung von Konservierungsmitteln auf Mikroorganismen zu vermeiden)
- Entnahmeinstrument: Kimura-Spatel oder Golfschneidemesser (zum Abschaben von Konjunktiva und Hornhaut). Oder ein Tupfer aus synthetischer Faser
- Entnahmestelle: Den Übergangsbereich zwischen Läsion und normalem Gewebe abschaben. Da sich an der Grenze zwischen entzündetem Bereich und normaler Hornhaut Erreger befinden, ist dieser Grenzbereich am besten geeignet
- Vermeidung des Austrocknens: Beim Entnehmen mit einem Tupfer diesen vorher mit steriler Kochsalzlösung anfeuchten. Austrocknung verschlechtert die Probenqualität
- Material des Tupfers: Material aus synthetischer Faser verwenden. Natürliche Materialien können das Wachstum von Mikroorganismen und die Untersuchungsmethode beeinflussen
Hinweise
Abschnitt betitelt „Hinweise“- In manchen Fällen ist die Läsion äußerst fragil. Nicht gewaltsam abschaben
- Es wurde berichtet, dass die Kultur-Positivrate beim Abschaben der Läsion mit einem Tupfer etwa 50 % beträgt und mit einer 23G-Nadel 35 % 1)
- Wenn die Probenmenge gering ist, vermerken Sie die Priorität der Untersuchungen deutlich im Labor
Am wichtigsten ist, die Probe vor der Gabe von Antibiotika zu entnehmen. Nach Antibiotika sinkt die Kultur-Positivitätsrate deutlich von 77,3% auf 37,8%. Die Entnahmestelle sollte der Übergangsbereich zwischen Läsion und normalem Gewebe sein; nicht das Zentrum der Entzündung, sondern den Rand abstreichen. Den Tupfer vorher mit steriler Kochsalzlösung anfeuchten, um Austrocknung zu verhindern. Verwenden Sie einen Tupfer aus synthetischen Fasern oder eine Kimura-Spatel oder ein Golfmesser, und führen Sie den Eingriff unter lokaler Tropfanästhesie durch. Ist die Läsion fragil, nicht mit Gewalt abstreichen.
3. Ausstrich- und mikroskopische Untersuchung (Färbemethoden und Beurteilung)
Abschnitt betitelt „3. Ausstrich- und mikroskopische Untersuchung (Färbemethoden und Beurteilung)“
Die entnommene Probe wird auf einen Objektträger ausgestrichen, gefärbt und unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Die Positivitätsrate der Ausstrichmikroskopie wird mit 58,1–73,7% angegeben1).
Schritte der Präparateherstellung
Abschnitt betitelt „Schritte der Präparateherstellung“- Den Objektträger mit Alkohol reinigen und die Ausstrichstelle auf der Rückseite mit einem Diamantstift oder Marker markieren
- Das Material dünn und leicht verstreicht ausstreichen. Bei einem Tupfer wird bei geringer Probenmenge leicht wie mit einem Stempel aufgetragen, bei ausreichender Menge durch Rollen ausgestrichen
- Mit Methylalkohol oder durch Flamme fixieren
Auswahl der Färbemethode
Abschnitt betitelt „Auswahl der Färbemethode“Je nach Zweck eine von fünf Färbemethoden auswählen.
- Giemsa-Färbung (Diff-Quik™): eine vielseitige Färbemethode für das Screening, auch bei infektiösen und nichtinfektiösen Ursachen. Mit dem Schnellfärbeset (Diff-Quik™) lässt sich in etwa 15 Sekunden eine mit der herkömmlichen Methode vergleichbare Färbung erzielen. Alle Mikroorganismen färben sich blau, Grampositive und Gramnegative lassen sich jedoch nicht unterscheiden1)
- Gram-Färbung: eine auf bakterielle Infektionen spezialisierte Färbemethode. Sie ermöglicht die Unterscheidung von Grampositiven und Gramnegativen und die Beurteilung der Bakterienform (Kokken oder Stäbchen). Mit Faver G (Nissui Pharmaceutical) ist sie in etwa 3 Minuten abgeschlossen1)
- FungiFloraY®-Färbung: ein fluoreszierender Farbstoff vom Stilbensulfonat-Typ. Er färbt selektiv β-verknüpfte Polysaccharide (Chitin und Cellulose) und weist Pilze (Hyphen und Hefen) sowie Acanthamoeba-Zysten empfindlich nach. Eine Beobachtung im Fluoreszenzmikroskop ist erforderlich1)
- Immunfluoreszenz: weist Virusantigene wie HSV (Herpes-simplex-Virus) und VZV (Varizella-Zoster-Virus) direkt nach1)
- Hansel-Färbung: eine Spezialfärbung zum Nachweis von Eosinophilen bei allergischen Bindehauterkrankungen
Vergrößerung in der Mikroskopie
Abschnitt betitelt „Vergrößerung in der Mikroskopie“- 400-fach: dient zur Identifizierung der Art der Entzündungszellen (Neutrophile haben einen Durchmesser von etwa 12–15 μm). Bei bakteriellen Infektionen überwiegen Neutrophile, bei viralen Infektionen Lymphozyten
- 1000-fache Ölimmersion: dient zur mikroskopischen Betrachtung von Mikroorganismen (Bakterien haben einen Durchmesser von etwa 1,0 μm)
Färbemethoden und typische Befunde je nach Erreger
Abschnitt betitelt „Färbemethoden und typische Befunde je nach Erreger“| Verdächtiger Erreger | Empfohlene Färbung | Typische Befunde |
|---|---|---|
| Bakterien (allgemein) | Gramfärbung | Grampositive/-negative Kokken und Stäbchen |
| Gonokokken | Diff-Quik™ | Kaffeebohnenförmige Diplokokken; innerhalb von Neutrophilen |
| Pilze | Fungiflora Y® | Hyphen und Konidien (fluoreszierend) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Doppeltwandige Zysten (etwa 10×10 μm) |
| Viren (z. B. HSV) | Fluoreszenz-Antikörper-Methode | Spezifische Fluoreszenz in infizierten Zellen |
| Eosinophile (Allergie) | Hansel-Färbung | Positiv schon bei nur 1 Eosinophilen |
4. Kulturuntersuchung
Abschnitt betitelt „4. Kulturuntersuchung“Bei der Kulturuntersuchung wird der verursachende Mikroorganismus auf einem Kulturmedium vermehrt, sodass seine Identifizierung und eine Medikamentenempfindlichkeitsprüfung möglich sind. Die Rate positiver Kulturen variiert je nach Einrichtung und Bedingungen zwischen 37,6 und 74,3 % 1). Da an der äußeren Augenoberfläche eine normale Flora vorhanden ist, ist das isolierte Keim nicht unbedingt der Erreger. Die Beurteilung erfolgt insgesamt anhand von mikroskopischen Befunden, Augenbefunden, Medikamentenempfindlichkeit und Therapieansprechen.
Hauptarten von Kulturmedien
Abschnitt betitelt „Hauptarten von Kulturmedien“| Kulturmedium | Zielmikroorganismus | Kulturbedingungen |
|---|---|---|
| Blutagar-Medium | gewöhnliche Bakterien (Hämolyse beurteilbar) | 37 °C, aerob |
| Schokoladenagar-Medium | Haemophilus-Arten und Gonokokken (enthält V- und X-Faktor) | 37 °C, CO2 |
| Sabouraud-/Kartoffel-Dextrose-Medium | Pilze | unter zwei Bedingungen kultiviert: 37 °C und Raumtemperatur |
| 1,5 % NN-Agarplatte | Acanthamoeba | 30 °C |
| Transportmedium (Seed Swab®, Transwab® usw.) | Häufige Bakterien (wenn die Einrichtung kein festes Medium hat) | Transport bei Raumtemperatur (Positivitätsrate 50–69 %)1) |
Aufbewahrung der Probe
Abschnitt betitelt „Aufbewahrung der Probe“Wie die Probe aufbewahrt wird, wenn der Transport ins Labor Zeit braucht, hängt von der Art des Erregers ab.
- Häufige Bakterien: Bei 4°C (Kühlschrank) aufbewahren
- Gonokokken und Meningokokken: Bei Raumtemperatur aufbewahren, da sie kälteempfindlich sind und leicht absterben
- Bei Verdacht auf obligat anaerobe Bakterien: In einem anaeroben Transportbehälter aufbewahren
Wichtige Punkte bei der Anforderung der Untersuchung
Abschnitt betitelt „Wichtige Punkte bei der Anforderung der Untersuchung“- Auf dem Anforderungsformular die klinischen Befunde und den Zielerreger klar angeben. Der Zusatz selektiver Medien verbessert die Nachweisrate
- Bei kleiner Probenmenge die Priorität der Untersuchungen vermerken (z. B. Kultur > Mikroskopie, Bakterien > Pilze)
Interpretation des Antibiogramms
Abschnitt betitelt „Interpretation des Antibiogramms“Bei der Empfindlichkeitsprüfung wählt man häufig das Medikament mit der niedrigeren MIC (minimalen Hemmkonzentration) unter den als S (sensibel) eingestuften Mitteln aus. Auch wenn es als R (resistent) beurteilt wird, kann es klinisch wirksam sein, daher ist eine Gesamtbewertung erforderlich. Beachten Sie, dass für die Empfindlichkeitsprüfung von Pilzen und Acanthamoeba keine Interpretationskriterien festgelegt sind 1).
Die Kulturpositivrate liegt bei 37.6–74.3 %, und ein negatives Ergebnis schließt eine Infektion nicht aus. Der wichtigste Einflussfaktor ist der Zeitpunkt der Probenentnahme; nach Gabe von Antimikrobiotika sinkt die Positivrate auf etwa die Hälfte. Außerdem beträgt die Kulturpositivrate bei smear-negativen Fällen 42.7–47.1 % und bei smear-positiven Fällen 57.1–82.4 %, sodass die Kombination beider Tests die diagnostische Genauigkeit erhöht. Da sich Acanthamoeba in allgemeinen Einrichtungen schwer isolieren und kultivieren lässt, sollte die mikroskopische Untersuchung mit Diff-Quik™-Färbung zur Bestätigung der doppelwandigen Struktur der Zyste Vorrang haben.
5. Eosinophilenuntersuchung (endgültige Diagnose der allergischen Bindehauterkrankung)
Abschnitt betitelt „5. Eosinophilenuntersuchung (endgültige Diagnose der allergischen Bindehauterkrankung)“
Für die endgültige Diagnose der allergischen Bindehauterkrankung müssen Eosinophile in einem Hansel-gefärbten Bindehautabschabungspräparat nachgewiesen werden 2).
Entnahmetechnik
Abschnitt betitelt „Entnahmetechnik“- Nach der Lokalanästhesie das Oberlid umstülpen
- Die Lidbindehaut mit einem Glasstab leicht massieren und das auf der Bindehautoberfläche angesammelte Sekret mit einer Pinzette oder einem Spatel entnehmen
- Auf einen Objektträger ausstreichen, Hansel-Färbung durchführen und unter dem Lichtmikroskop beobachten
Beurteilung
Abschnitt betitelt „Beurteilung“Wenn unter dem Mikroskop auch nur ein Eosinophil nachgewiesen werden kann, wird das Ergebnis als positiv gewertet, und es ist die gesicherte Diagnose einer allergischen Bindehauterkrankung2). Wenn bei der Entnahme eine Blutung auftritt, können Eosinophile aus dem Blut in die Probe gelangen; deshalb wird die Untersuchung am anderen Auge wiederholt.
Diagnosesystem der allergischen Bindehauterkrankung
Abschnitt betitelt „Diagnosesystem der allergischen Bindehauterkrankung“Die drei diagnostischen Stufen auf Grundlage der Leitlinie zur Behandlung allergischer Bindehauterkrankungen (3. Auflage) sind wie folgt2).
| Diagnosekategorie | Erforderliche Bedingungen |
|---|---|
| Klinische Diagnose | Nur klinische Befunde (allergische Symptome und Befunde) |
| Klinisch gesicherte Diagnose | Klinische Befunde + Nachweis einer allergischen Veranlagung (positives Gesamt-IgE in der Tränenflüssigkeit, Hauttest, positives allergenspezifisches Serum-IgE) |
| Gesicherte Diagnose | Klinische Befunde + positiver Eosinophilen-Test (Nachweis einer lokalen allergischen Reaktion am Auge) |
Die klinisch gesicherte Diagnose bestätigt nur eine systemische allergische Veranlagung und belegt nicht direkt eine allergische Reaktion im Auge selbst. Erst wenn der Eosinophilen-Test die lokale allergische Reaktion am Auge direkt nachweist, gilt dies als gesicherte Diagnose2).
6. Interpretation der Untersuchungsergebnisse und Gesamtbeurteilung
Abschnitt betitelt „6. Interpretation der Untersuchungsergebnisse und Gesamtbeurteilung“Erregerverdacht anhand der Art der Entzündungszellen
Abschnitt betitelt „Erregerverdacht anhand der Art der Entzündungszellen“Auch wenn keine Erreger gefunden werden, kann die Art der Entzündungszellen ein Hinweis auf den wahrscheinlichen Erreger sein.
- Überwiegen von Neutrophilen → spricht für eine bakterielle Infektion
- Überwiegen von Lymphozyten → spricht für eine Virusinfektion
- Überwiegen von Eosinophilen → spricht für eine allergische oder parasitäre Infektion
Gesamtbeurteilung des verursachenden Erregers
Abschnitt betitelt „Gesamtbeurteilung des verursachenden Erregers“Ob der isolierte Keim der verursachende Erreger ist, wird insgesamt beurteilt.
- Übereinstimmung zwischen dem mikroskopischen Befund und dem in der Kultur isolierten Keim (ob der unter dem Mikroskop gesehene Keim mit dem in der Kultur gewachsenen Keim übereinstimmt)
- Übereinstimmung mit den Augenbefunden (ob die Probe aus dem Läsionsgebiet entnommen wurde)
- Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des Arzneimittelempfindlichkeitstests und der tatsächlichen Behandlungswirkung
Vorsicht bei speziellen Erregern
Abschnitt betitelt „Vorsicht bei speziellen Erregern“- Gonokokken: Sie sind empfindlich gegenüber Austrocknung und Temperaturschwankungen und sterben leicht ab. Eine sofortige Bearbeitung nach der Entnahme ist unerlässlich. Eine Lagerung im Kühlschrank ist ungeeignet (bei Raumtemperatur aufbewahren)
- Acanthamoeba: Die Isolierung und Kultur sind in allgemeinen Einrichtungen schwierig. Bei der Dif-Quik™-Färbung sollte die Bestätigung von Zysten mit Doppelwand Priorität haben
Kombination aus Abstrichmikroskopie und Kulturuntersuchung
Abschnitt betitelt „Kombination aus Abstrichmikroskopie und Kulturuntersuchung“Selbst bei Fällen mit negativem Abstrich unter dem Mikroskop kann die Kulturpositivrate 42,7–47,1% erreichen1). Andererseits liegt die Kulturpositivrate bei Abstrich-positiven Fällen bei 57,1–82,4%, und die gleichzeitige Durchführung beider Untersuchungen erhöht die Sensitivität. Die PCR-Untersuchung ist als Ergänzung zur Abstrichmikroskopie und Kulturuntersuchung nützlich, aber eine Diagnose der bakteriellen Keratitis nur anhand der PCR wird nicht empfohlen1).
7. Neueste Forschung und zukünftige Perspektiven
Abschnitt betitelt „7. Neueste Forschung und zukünftige Perspektiven“- Metagenomische Analyse (Next-Generation-Sequenzierung): Es wird zunehmend möglich, das Mikrobiom der Augenoberfläche umfassend zu analysieren, einschließlich nicht kultivierbarer Mikroorganismen. Es wird erwartet, dass Erreger nachgewiesen werden können, die mit herkömmlichen Kulturuntersuchungen nicht identifiziert werden können
- Multiplex-PCR: Die Entwicklung von Systemen, die mehrere Erreger (Bakterien, Pilze, Viren und Acanthamoeba) in einer einzigen Untersuchung gleichzeitig schnell nachweisen können, schreitet voran. Eine Verbesserung der diagnostischen Genauigkeit und Geschwindigkeit bei infektiöser Keratitis wird erwartet3)
- MALDI-TOF-Massenspektrometrie: Eine Massenspektrometrie-Technik, mit der kultivierte Bakterien in nur wenigen Minuten identifiziert werden können. Im Vergleich zu herkömmlichen biochemischen Identifikationsmethoden ist eine deutliche Zeitersparnis möglich, und die Anwendung in der ophthalmologischen Infektionsdiagnostik wird erforscht4)
- Verfeinerung der Sensitivität und Spezifität von Eosinophilen-Tests: Die Entwicklung hochsensitiver Nachweismethoden für Eosinophile unter Verwendung von Elektronenmikroskopie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern schreitet voran. Die herkömmliche Hansel-Färbung hat Grenzen in der Nachweissensitivität, und wenn eine sensitivere Methode etabliert wird, könnte sich die diagnostische Genauigkeit verbessern
8. Literaturverzeichnis
Abschnitt betitelt „8. Literaturverzeichnis“- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.