Cytologie et culture conjonctivales (examens d’infection et d’allergie)
1. Qu’est-ce que la cytologie et la culture du grattage conjonctival
Section intitulée « 1. Qu’est-ce que la cytologie et la culture du grattage conjonctival »La cytologie du grattage conjonctival et la culture microbienne sont des examens utilisés pour identifier le germe responsable dans les maladies oculaires infectieuses, réaliser un test de sensibilité aux médicaments et confirmer les éosinophiles dans la maladie conjonctivale allergique (diagnostic définitif). En identifiant tôt le germe responsable et en choisissant un antibiotique efficace, on peut espérer une amélioration des signes d’infection.
Les recommandations pour le diagnostic et le traitement de la kératite infectieuse (3e édition) recommandent fortement d’effectuer un examen direct sur frottis et une culture en cas de suspicion de kératite infectieuse (niveau de preuve : C)1). Ces examens sont considérés comme essentiels, en particulier dans les cas de kératite urgente ou d’endophtalmie, ou lorsqu’on suspecte la présence d’un germe responsable inhabituel.
Dans les recommandations pour le diagnostic et le traitement de la maladie conjonctivale allergique (3e édition), l’examen des éosinophiles (coloration de Hansel) est clairement indiqué comme base du diagnostic définitif, et c’est un examen indispensable pour faire passer un diagnostic clinique à un diagnostic définitif2).
Indications
Section intitulée « Indications »En cas de suspicion de maladie infectieuse
Section intitulée « En cas de suspicion de maladie infectieuse »- Kératite et conjonctivite bactériennes (surtout urgentes)
- Conjonctivite gonococcique (le diagnostic précoce est important car elle peut entraîner une perforation cornéenne)
- Kératite à Acanthamoeba (la culture est difficile dans les structures générales, donc un examen microscopique est recommandé)
- Kératite fongique
- Cas où l’on suspecte un agent causal particulier (comme une kératite réfractaire ou résistante au traitement)
Diagnostic de certitude des maladies oculaires allergiques
Section intitulée « Diagnostic de certitude des maladies oculaires allergiques »- Conjonctivite allergique (diagnostic de certitude par examen des éosinophiles)
- Kératoconjonctivite vernale (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Kératoconjonctivite atopique (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Elle est réalisée בעיקרement pour deux objectifs. D’abord, lorsqu’une kératite infectieuse ou une conjonctivite est suspectée ; c’est un examen indispensable, surtout dans les infections urgentes comme la kératite et l’endophtalmie, ou lorsque l’on suspecte des agents causals particuliers comme le gonocoque, l’Acanthamoeba ou des champignons. Ensuite, elle sert à confirmer une maladie conjonctivale allergique ; si l’on identifie ne serait-ce qu’un éosinophile avec la coloration de Hansel, le diagnostic est confirmé. Les seuls signes cliniques ne permettent qu’un diagnostic clinique, donc l’examen des éosinophiles est réalisé lorsqu’un diagnostic définitif est nécessaire.
2. Technique de prélèvement
Section intitulée « 2. Technique de prélèvement »Le principe est de prélever fermement l’échantillon au niveau de la zone où l’on suspecte la présence du germe causal. Le moment du prélèvement influence beaucoup le taux de positivité. Le taux de positivité de la culture avant les antibiotiques est de 77,3 %, alors qu’après traitement il descend à 37,8 % 1). Il faut donc prélever l’échantillon avant d’administrer des antibiotiques.
Préparation et procédure
Section intitulée « Préparation et procédure »- Anesthésie : utiliser une anesthésie en gouttes ophtalmiques. Une préparation sans conservateur est préférable (pour éviter l’effet des conservateurs sur les microorganismes)
- Instrument de prélèvement : spatule de Kimura ou lame de golf (pour le grattage de la conjonctive et de la cornée). Ou un écouvillon en fibre synthétique
- Site de prélèvement : gratter la zone de transition entre la lésion et le tissu normal. Comme des germes se trouvent à la limite entre la zone inflammatoire et la cornée normale, cette zone de transition est la plus adaptée
- Prévention du dessèchement : lors d’un prélèvement avec écouvillon, l’humidifier au préalable avec du sérum physiologique stérile. Le dessèchement diminue la qualité de l’échantillon
- Matériau de l’écouvillon : utiliser un matériau en fibre synthétique. Les matériaux naturels peuvent influencer la croissance microbienne et la méthode d’examen
Précautions
Section intitulée « Précautions »- Dans certains cas, la lésion est extrêmement fragile. Ne pas gratter de force
- Il a été rapporté que le taux de positivité de la culture lors du grattage de la lésion avec un écouvillon est d’environ 50 %, et de 35 % avec une aiguille de 23G 1)
- Si la quantité d’échantillon est faible, indiquez clairement au laboratoire la priorité des examens
Le point le plus important est de prélever avant l’administration d’antibiotiques. Après antibiotiques, le taux de positivité de la culture chute nettement, de 77,3% à 37,8%. Le site de prélèvement doit être la zone de transition entre la lésion et le tissu normal ; il faut racler le bord et non le centre de l’inflammation. Humidifiez d’abord l’écouvillon avec du sérum physiologique stérile pour éviter le dessèchement. Utilisez un écouvillon en fibre synthétique ou une spatule de Kimura ou un couteau de golf, et réalisez le geste sous anesthésie locale en gouttes. Si la lésion est fragile, ne grattez pas avec force.
3. Frottis et examen microscopique (méthodes de coloration et interprétation)
Section intitulée « 3. Frottis et examen microscopique (méthodes de coloration et interprétation) »
L’échantillon prélevé est étalé sur une lame de verre, coloré, puis observé au microscope optique. Le taux de positivité de l’examen microscopique sur frottis est rapporté à 58,1–73,7%1).
Étapes de préparation de l’échantillon
Section intitulée « Étapes de préparation de l’échantillon »- Nettoyez la lame de verre avec de l’alcool, puis marquez au verso la zone d’étalement de l’échantillon avec un crayon de diamant ou un marqueur
- Étalez le matériau en couche mince, en le répartissant délicatement. Avec un écouvillon, si la quantité d’échantillon est faible, étalez-le en appuyant légèrement comme pour tamponner ; s’il y en a suffisamment, étalez-le en le faisant rouler
- Fixez avec de l’alcool méthylique ou à la flamme
Choix de la méthode de coloration
Section intitulée « Choix de la méthode de coloration »Choisir parmi cinq méthodes de coloration selon l’objectif.
- Coloration de Giemsa (Diff-Quik™) : méthode de coloration polyvalente utilisée pour le dépistage, y compris les causes infectieuses et non infectieuses. Avec le kit de coloration rapide (Diff-Quik™), une coloration équivalente à la méthode conventionnelle est obtenue en environ 15 secondes. Tous les microorganismes se colorent en bleu, mais il n’est pas possible de distinguer les Gram positifs des Gram négatifs1)
- Coloration de Gram : méthode de coloration spécialisée dans les infections bactériennes. Elle permet de distinguer les Gram positifs des Gram négatifs et d’observer la morphologie bactérienne (coques ou bacilles). Avec Faver G (Nissui Pharmaceutical), cela peut être réalisé en environ 3 minutes1)
- Coloration FungiFloraY® : colorant fluorescent de type acide stilbène sulfonique. Il colore sélectivement les polysaccharides à liaisons β (chitine et cellulose) et détecte avec sensibilité les champignons (hyphes et levures) ainsi que les kystes d’Acanthamoeba. Une observation au microscope à fluorescence est nécessaire1)
- Immunofluorescence : met directement en évidence des antigènes viraux tels que HSV (virus de l’herpès simplex) et VZV (virus varicelle-zona)1)
- Coloration de Hansel : coloration spéciale utilisée pour détecter les éosinophiles dans les maladies conjonctivales allergiques
Grossissement au microscope
Section intitulée « Grossissement au microscope »- 400x : utilisé pour identifier le type de cellules inflammatoires (les neutrophiles mesurent environ 12 à 15 μm de diamètre). Dans les infections bactériennes, les neutrophiles prédominent ; dans les infections virales, ce sont les lymphocytes
- 1000x à immersion dans l’huile : utilisé pour observer les microorganismes (les bactéries ont un diamètre d’environ 1,0 μm)
Méthodes de coloration et signes caractéristiques selon le pathogène
Section intitulée « Méthodes de coloration et signes caractéristiques selon le pathogène »| Agent pathogène suspecté | Coloration recommandée | Signes caractéristiques |
|---|---|---|
| Bactéries (général) | Coloration de Gram | Coques et bacilles Gram positifs/négatifs |
| Gonocoque | Diff-Quik™ | Diplocoques en forme de grain de café ; phagocytés dans les neutrophiles |
| Champignons | Fungiflora Y® | Hyphes et conidies (fluorescence) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Kystes à double paroi (environ 10×10 μm) |
| Virus (comme HSV) | Méthode aux anticorps fluorescents | Fluorescence spécifique dans les cellules infectées |
| Éosinophiles (allergie) | Coloration de Hansel | Positif même avec un seul éosinophile |
4. Examen de culture
Section intitulée « 4. Examen de culture »Lors de l’examen de culture, le micro-organisme en cause est mis en culture sur un milieu de culture, ce qui permet son identification et le test de sensibilité aux médicaments. Le taux de cultures positives varie selon l’établissement et les conditions, de 37,6 à 74,3 % 1). Comme la surface oculaire externe héberge une flore normale, le germe isolé n’est pas forcément l’agent causal. L’évaluation doit se faire de manière globale à partir des résultats de l’examen microscopique, des signes oculaires, de la sensibilité aux médicaments et de la réponse au traitement.
Principaux types de milieux de culture
Section intitulée « Principaux types de milieux de culture »| Milieu de culture | Micro-organisme ciblé | Conditions de culture |
|---|---|---|
| milieu gélose au sang | bactéries courantes (évaluation de l’hémolyse possible) | 37 °C, aérobie |
| milieu gélose chocolat | Haemophilus et gonocoques (contient les facteurs V et X) | 37 °C, CO2 |
| milieu Sabouraud/potato dextrose | champignons | cultivé dans deux conditions : 37 °C et température ambiante |
| boîte de gélose NN à 1,5 % | Acanthamoeba | 30 °C |
| Milieu de transport (Seed Swab®, Transwab®, etc.) | Bactéries courantes (lorsque le site ne dispose pas de milieu solide) | Transport à température ambiante (taux de positivité 50–69 %)1) |
Conservation de l’échantillon
Section intitulée « Conservation de l’échantillon »La façon de conserver l’échantillon lorsqu’il faut du temps avant son envoi au laboratoire dépend du type de micro-organisme responsable.
- Bactéries courantes : conserver à 4°C (réfrigérateur)
- Gonocoques et méningocoques : conserver à température ambiante, car ils sont sensibles au froid et meurent facilement
- Si l’on suspecte des bactéries anaérobies strictes : conserver dans un contenant de transport anaérobie
Points clés pour prescrire l’examen
Section intitulée « Points clés pour prescrire l’examen »- Indiquer clairement sur la demande les constatations cliniques et le micro-organisme ciblé. L’ajout de milieux sélectifs améliore le taux de détection
- Si la quantité d’échantillon est faible, préciser la priorité des examens (par exemple : culture > examen microscopique, bactéries > champignons)
Interprétation de l’antibiogramme
Section intitulée « Interprétation de l’antibiogramme »Lors des tests de sensibilité, on choisit souvent le médicament dont la CMI (concentration minimale inhibitrice) est la plus faible parmi ceux classés S (sensible). Toutefois, même s’il est classé R (résistant), il peut rester efficace en pratique, d’où la nécessité d’une évaluation globale. Il faut noter que, pour les tests de sensibilité des champignons et d’Acanthamoeba, les critères d’interprétation ne sont pas établis 1).
Le taux de positivité des cultures est de 37.6–74.3 %, et un résultat négatif n’exclut pas une infection. Le facteur le plus influent est le moment du prélèvement ; lorsqu’il est effectué après l’administration d’antimicrobiens, le taux de positivité est réduit d’environ moitié. De plus, le taux de positivité des cultures est de 42.7–47.1 % lorsque le frottis est négatif, et de 57.1–82.4 % lorsqu’il est positif ; l’association des deux examens améliore donc la précision du diagnostic. Comme l’Acanthamoeba est difficile à isoler et à cultiver dans les structures générales, il faut privilégier l’examen microscopique avec coloration Diff-Quik™ pour confirmer la structure à double paroi du kyste.
5. Examen des éosinophiles (diagnostic de certitude de la maladie conjonctivale allergique)
Section intitulée « 5. Examen des éosinophiles (diagnostic de certitude de la maladie conjonctivale allergique) »
Pour poser le diagnostic de certitude de la maladie conjonctivale allergique, il faut détecter des éosinophiles dans un frottis de grattage conjonctival coloré au Hansel 2).
Technique de prélèvement
Section intitulée « Technique de prélèvement »- Après anesthésie topique, retourner la paupière supérieure
- Masser doucement la conjonctive palpébrale avec une tige de verre, puis recueillir avec une pince ou une spatule le mucus accumulé à la surface conjonctivale
- Étaler sur une lame, réaliser la coloration de Hansel, puis observer au microscope optique
Interprétation
Section intitulée « Interprétation »Si l’on peut observer ne serait-ce qu’un seul éosinophile au microscope, le résultat est jugé positif, et cela confirme le diagnostic définitif de la maladie conjonctivale allergique2). Si un saignement est observé lors du prélèvement, des éosinophiles provenant du sang peuvent se mélanger à l’échantillon ; il faut donc refaire l’examen dans l’autre œil.
Système diagnostique de la maladie conjonctivale allergique
Section intitulée « Système diagnostique de la maladie conjonctivale allergique »Les trois étapes du diagnostic, d’après les Lignes directrices de prise en charge de la maladie conjonctivale allergique (3e édition), sont les suivantes2).
| Catégorie diagnostique | Conditions requises |
|---|---|
| Diagnostic clinique | Signes cliniques seuls (symptômes et signes allergiques) |
| Diagnostic clinique confirmé | Signes cliniques + confirmation d’une prédisposition allergique (IgE totale dans les larmes positive, test cutané, IgE sérique spécifique de l’antigène positive) |
| Diagnostic définitif | Signes cliniques + test des éosinophiles positif (confirmation d’une réaction allergique locale oculaire) |
Le diagnostic clinique confirmé ne fait que confirmer une prédisposition allergique systémique et ne prouve pas directement une réaction allergique au niveau de l’œil. Le diagnostic n’est définitif que lorsque le test des éosinophiles prouve directement une réaction allergique locale oculaire2).
6. Interprétation des résultats des examens et évaluation globale
Section intitulée « 6. Interprétation des résultats des examens et évaluation globale »Estimation du pathogène selon le type de cellules inflammatoires
Section intitulée « Estimation du pathogène selon le type de cellules inflammatoires »Même en l’absence de bactéries visibles, le type de cellules inflammatoires peut fournir un indice sur le pathogène probable.
- Prédominance de neutrophiles → suggère une infection bactérienne
- Prédominance de lymphocytes → suggère une infection virale
- Prédominance d’éosinophiles → suggère une infection allergique ou parasitaire
Évaluation globale du germe responsable
Section intitulée « Évaluation globale du germe responsable »Le fait que le germe isolé soit ou non le germe responsable est évalué de manière globale.
- Concordance entre les résultats de l’examen microscopique et le germe isolé en culture (le germe vu au microscope correspond-il à celui qui a poussé en culture)
- Concordance avec les constatations oculaires (l’échantillon a-t-il été prélevé sur la lésion)
- Concordance entre les résultats du test de sensibilité aux médicaments et l’effet réel du traitement
Attention aux pathogènes particuliers
Section intitulée « Attention aux pathogènes particuliers »- gonocoque : il est vulnérable au dessèchement et aux variations de température, et meurt facilement. Un traitement immédiat après le prélèvement est indispensable. La conservation au froid est inadaptée (conserver à température ambiante)
- Acanthamoeba : l’isolement et la culture sont difficiles dans les structures générales. Avec la coloration Dif-Quik™, il faut d’abord confirmer des kystes à double paroi
Association de l’examen microscopique sur frottis et de la culture
Section intitulée « Association de l’examen microscopique sur frottis et de la culture »Même dans les cas négatifs à l’examen microscopique sur frottis, le taux de positivité de la culture peut atteindre 42,7–47,1%1). En revanche, dans les cas positifs au frottis, le taux de positivité de la culture est de 57,1–82,4%, et la réalisation simultanée des deux examens augmente la sensibilité. La PCR est utile comme aide à l’examen microscopique sur frottis et à la culture, mais il n’est pas recommandé de diagnostiquer une kératite bactérienne sur la seule base de la PCR1).
7. Recherches récentes et perspectives d’avenir
Section intitulée « 7. Recherches récentes et perspectives d’avenir »- Analyse métagénomique (séquençage de nouvelle génération) : il devient possible d’analyser de manière exhaustive le microbiome de la surface oculaire, y compris les micro-organismes non cultivables. On espère ainsi détecter des agents pathogènes non identifiables par les cultures traditionnelles
- PCR multiplex : le développement de systèmes capables de détecter rapidement et simultanément plusieurs agents pathogènes (bactéries, champignons, virus et Acanthamoeba) en un seul examen progresse. On attend une amélioration de la précision et de la rapidité du diagnostic de la kératite infectieuse3)
- Spectrométrie de masse MALDI-TOF : technique de spectrométrie de masse permettant d’identifier des bactéries cultivées en quelques minutes seulement. Par rapport aux méthodes biochimiques conventionnelles, elle permet de réduire considérablement le temps, et son application aux infections ophtalmiques est à l’étude4)
- Affinage de la sensibilité et de la spécificité du test des éosinophiles : le développement de méthodes de détection à haute sensibilité des éosinophiles à l’aide de la microscopie électronique et d’anticorps marqués par fluorescence progresse. La coloration de Hansel classique présente des limites de sensibilité de détection, et si une méthode plus sensible est établie, la précision diagnostique pourrait s’améliorer
8. Références
Section intitulée « 8. Références »- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.