结膜刮片细胞学检查与培养检查（感染和过敏检查）
1. 什么是结膜刮片细胞学和培养检查
Section titled “1. 什么是结膜刮片细胞学和培养检查”结膜刮片细胞学和微生物培养检查，是用于识别感染性眼病的致病菌、进行药物敏感性试验，以及确认过敏性结膜疾病中的嗜酸性粒细胞（明确诊断）的检查。尽早确定致病菌并选择有效的抗菌药物，可改善感染表现。
《感染性角膜炎诊疗指南（第3版）》强烈建议在怀疑感染性角膜炎时进行涂片镜检和培养检查（证据强度C）1)。尤其在紧急性角膜炎、眼内炎，或怀疑存在特殊致病菌的病例中，这是必需检查。
《过敏性结膜疾病诊疗指南（第3版）》明确指出，嗜酸性粒细胞检查（Hansel染色）是明确诊断的依据，也是将临床诊断升级为明确诊断不可缺少的检查2)。
怀疑感染性疾病时
Section titled “怀疑感染性疾病时”- 细菌性角膜炎和结膜炎（尤其是紧急情况）
- 淋菌性结膜炎（因可导致角膜穿孔，早期诊断很重要）
- 棘阿米巴角膜炎（一般机构难以培养，建议进行镜检）
- 真菌性角膜炎
- 怀疑特殊致病菌的病例（如难治性、治疗抵抗性角膜炎等）
过敏性眼病的确诊
Section titled “过敏性眼病的确诊”- 过敏性结膜炎（通过嗜酸性粒细胞检查确诊）
- 春季角结膜炎（vernal keratoconjunctivitis: VKC）
- 特应性角结膜炎（atopic keratoconjunctivitis: AKC）
2. 标本采集手法
Section titled “2. 标本采集手法”原则上应从怀疑存在致病菌的部位充分采集标本。采集时机会极大影响阳性率。抗菌药使用前的培养阳性率为 77.3%，而使用后则降至 37.8% 1)。务必在使用抗菌药之前采集标本。
- 麻醉：使用滴眼麻醉。最好选择不含防腐剂的制剂（以避免防腐剂对微生物的影响）
- 采集器具：Kimura 刮板或高尔夫刀（用于结膜和角膜刮取）。也可使用化学纤维棉拭子
- 采集部位：刮取病灶与正常组织的交界区。因为炎症部位与正常角膜的交界处存在细菌，所以该交界区最为合适
- 防止干燥：使用棉拭子采集时，先用无菌生理盐水将棉拭子润湿。干燥会降低标本质量
- 棉拭子材质：使用化学纤维材质。天然材质可能影响微生物生长和检测方法
- 有些病例的病灶非常脆弱。不要强行刮取
- 有报道显示，用棉拭子刮取病灶的培养阳性率约为 50%，而使用 23G 针时为 35% 1)
- 如果取材量较少，请在检验科明确注明检验优先顺序
最重要的是在给予抗菌药物之前取样。用药后，培养阳性率会从77.3%大幅下降到37.8%。取样部位应选择病灶与正常组织的交界区，而不是炎症中心，而是擦取边缘部位。为防止干燥，应事先用无菌生理盐水润湿棉拭子。取材器具可使用化学纤维棉拭子，或Kimura spatula、golf刀，并在点眼麻醉下进行。如果病灶较脆弱，不要强行擦取。
3. 涂片·显微镜检查（染色方法与判定）
Section titled “3. 涂片·显微镜检查（染色方法与判定）”
将采集的标本涂抹于载玻片上，染色后在光学显微镜下观察。涂片镜检阳性率据称为58.1–73.7%1)。
标本制备步骤
Section titled “标本制备步骤”- 用酒精擦拭载玻片，并在背面用钻石笔或记号笔标出标本涂抹区域
- 用刮片器轻轻摊开，薄薄地涂抹。棉拭子在标本量少时可像盖印一样轻压涂抹，量较多时可像滚动一样涂抹
- 用甲醇或火焰固定
染色方法的选择
Section titled “染色方法的选择”根据目的从5种染色方法中选择。
- 吉姆萨染色（Diff-Quik™）：一种用于筛查的多用途染色法，可用于包括感染性和非感染性原因在内的检查。使用快速染色试剂盒（Diff-Quik™），约15秒即可获得与传统方法相当的染色效果。所有微生物都会染成蓝色，但无法区分革兰阳性和革兰阴性1)
- 革兰染色：专用于细菌感染的染色法。可区分革兰阳性和革兰阴性，并能观察细菌形态（球菌、杆菌）。使用 Faver G（日水制药）可在约3分钟内完成1)
- FungiFloraY®染色：一种芪基磺酸类荧光染料。可特异性染色β结构多糖（几丁质和纤维素），并灵敏检出真菌（菌丝和酵母）以及棘阿米巴包囊。需要使用荧光显微镜观察1)
- 免疫荧光法：可直接证明HSV（单纯疱疹病毒）、VZV（水痘-带状疱疹病毒）等病毒抗原1)
- Hansel染色：用于检测过敏性结膜疾病中嗜酸性粒细胞的专用染色法
- 400倍：用于确认炎症细胞的种类（中性粒细胞直径约12～15 μm）。细菌感染时以中性粒细胞为主，病毒感染时以淋巴细胞为主
- 1000倍油镜：用于观察菌体（细菌直径约1.0 μm）
按病原体分类的染色方法和特征性所见
Section titled “按病原体分类的染色方法和特征性所见”| 疑似病原体 | 推荐染色法 | 特征性所见 |
|---|---|---|
| 细菌（一般） | 革兰染色 | 革兰阳性/阴性的球菌和杆菌 |
| 淋菌 | Diff-Quik™ | 咖啡豆状双球菌；位于中性粒细胞内 |
| 真菌 | Fungiflora Y® | 菌丝和分生子（荧光） |
| 棘阿米巴 | Fungiflora Y® | 双层囊肿（约10×10 μm） |
| 病毒（如 HSV） | 荧光抗体法 | 感染细胞的特异性荧光 |
| 嗜酸性粒细胞（过敏） | 汉塞尔染色 | 即使只有 1 个嗜酸性粒细胞也算阳性 |
4. 培养检查
Section titled “4. 培养检查”在培养检查中，将致病微生物在培养基上繁殖，从而可以进行鉴定和药物敏感性试验。培养阳性率因机构和条件而异，为 37.6～74.3% 1)。由于眼外部存在常驻菌，分离出的菌不一定就是致病菌。应结合镜检结果、眼部所见、药物敏感性和治疗效果综合判断。
主要培养基类型
Section titled “主要培养基类型”| 培养基 | 目标微生物 | 培养条件 |
|---|---|---|
| 血琼脂培养基 | 一般细菌（可判断溶血性） | 37℃，需氧 |
| 巧克力琼脂培养基 | 流感嗜血杆菌属、淋球菌（含V因子、X因子） | 37℃，CO2 |
| 沙保罗/马铃薯葡萄糖培养基 | 真菌 | 在37℃和室温两种条件下培养 |
| 1.5% NN琼脂平板 | 棘阿米巴 | 30℃ |
| 运输培养基（Seed Swab®、Transwab®等） | 常见细菌（机构没有固体培养基时） | 常温运输（阳性率50〜69%）1) |
当运送到检验机构需要时间时，标本的保存方法会因致病菌种类而异。
- 常见细菌：4°C（冰箱）保存
- 淋球菌、脑膜炎球菌：对低温敏感，容易死亡，因此应常温保存
- 怀疑专性厌氧菌时：放入厌氧运输器中保存
检验申请要点
Section titled “检验申请要点”- 在申请单上明确填写临床所见和目标微生物。加入选择性培养基可提高检出率
- 如果采集量少，请注明检验优先顺序（例如：培养>镜检，细菌>真菌）
药物敏感性试验的解读
Section titled “药物敏感性试验的解读”在药物敏感性试验中，通常会从判定为S（敏感）的药物里选择MIC（最小抑菌浓度）较低的药物。不过，即使判定为R（耐药），临床上也可能有效，因此需要综合评估。请注意，真菌和棘阿米巴的药物敏感性试验尚未建立判定标准1)。
培养阳性率为37.6–74.3%，即使阴性也不能排除感染。影响最大的因素是标本采集时机；在使用抗菌药后采集时，阳性率约减半。另外，涂片阴性病例的培养阳性率为42.7–47.1%，涂片阳性病例为57.1–82.4%，因此联合这两项检查可提高诊断准确性。由于棘阿米巴在一般机构中难以分离培养，应优先采用Diff-Quik™染色的镜检来确认包囊的双层壁结构。
5. 嗜酸性粒细胞检查（过敏性结膜疾病的确诊）
Section titled “5. 嗜酸性粒细胞检查（过敏性结膜疾病的确诊）”
过敏性结膜疾病的确诊需要在汉塞尔染色的结膜刮片涂片中检出嗜酸性粒细胞2)。
- 点眼麻醉后，将上眼睑翻转
- 用玻璃棒轻轻按摩睑结膜，并用镊子或刮片采集聚集在结膜表面的黏液
- 涂抹于载玻片上，进行汉塞尔染色，并在光学显微镜下观察
只要在显微镜下能确认到哪怕1个嗜酸性粒细胞，即判定为阳性，并成为过敏性结膜疾病的确诊2)。如果采样时有出血，血液中的嗜酸性粒细胞可能混入，因此应在另一只眼重新检查。
过敏性结膜疾病的诊断体系
Section titled “过敏性结膜疾病的诊断体系”基于《过敏性结膜疾病诊疗指南（第3版）》的诊断三阶段如下2)。
| 诊断类别 | 必要条件 |
|---|---|
| 临床诊断 | 仅临床所见（过敏性症状和体征） |
| 临床确诊 | 临床所见 + 过敏素因确认（泪液总IgE阳性、皮肤试验、血清抗原特异性IgE阳性） |
| 确诊 | 临床所见 + 嗜酸性粒细胞检查阳性（确认眼局部过敏反应） |
临床确诊只能确认全身性过敏素因，并不能直接证明眼部局部的过敏反应。只有通过嗜酸性粒细胞检查直接证明眼局部过敏反应时，才可作出确诊2)。
6. 检查结果的解读与综合判断
Section titled “6. 检查结果的解读与综合判断”根据炎症细胞的类型推测病原体
Section titled “根据炎症细胞的类型推测病原体”即使没有发现菌体，炎症细胞的类型也可作为推测病原体的线索。
- 中性粒细胞为主 → 提示细菌感染
- 淋巴细胞为主 → 提示病毒感染
- 嗜酸性粒细胞为主 → 提示过敏性或寄生虫感染
致病菌的综合判断
Section titled “致病菌的综合判断”分离出的菌是否为致病菌，需要综合判断。
- 显微镜检查结果与培养分离菌的一致性（显微镜下看到的菌与培养中生长的菌是否一致）
- 与眼部所见的一致性（是否为从病灶部位采集的标本）
- 药物敏感性试验结果与实际治疗效果的一致性
注意特殊病原体
Section titled “注意特殊病原体”- 淋球菌：对干燥和温度变化很敏感，容易死亡。采集后必须立即处理。不适合冷藏保存（应室温保存）
- 棘阿米巴：在一般机构中分离培养较困难。使用 Dif-Quik™ 染色时，应优先确认具有双层壁结构的包囊
涂片镜检与培养检查的联合应用
Section titled “涂片镜检与培养检查的联合应用”即使涂片镜检为阴性的病例，培养阳性率也可达到42.7%～47.1%1)。另一方面，涂片镜检阳性的病例培养阳性率为57.1%～82.4%，两项检查同时进行可提高敏感性。PCR检查可作为涂片镜检和培养检查的辅助，但不推荐仅凭PCR诊断细菌性角膜炎1)。
7. 最新研究与未来展望
Section titled “7. 最新研究与未来展望”- 宏基因组分析（下一代测序）：正逐步能够对眼表微生物组进行全面解析，包括无法培养的微生物。可望检出传统培养检查无法识别的病原体
- 多重PCR：正在开发可在一次检查中同时快速检测多种病原体（细菌、真菌、病毒和棘阿米巴）的系统。可望提高感染性角膜炎的诊断准确性和速度3)
- MALDI-TOF 质谱法：一种可在短短几分钟内鉴定培养菌的质谱技术。与传统生化鉴定法相比，可大幅缩短时间，正在研究其在眼科感染中的应用4)
- 嗜酸性粒细胞检查的灵敏度和特异度精细化：正在开发利用电子显微镜和荧光标记抗体的高灵敏度嗜酸性粒细胞检测方法。传统的 Hansel 染色在检测灵敏度上有局限，如果能够建立更高灵敏度的检测方法，诊断准确性有望提高
8. 参考文献
Section titled “8. 参考文献”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.