Citologia e cultura conjuntival (exames de infecção e alergia)

A citologia e a cultura de raspado conjuntival são usadas para identificar o agente causador nas doenças oculares infecciosas, realizar teste de sensibilidade aos medicamentos e confirmar a doença conjuntival alérgica.
A taxa de positividade na microscopia de esfregaço é de 58,1–73,7%, e a taxa de positividade na cultura é de 37,6–74,3%; coletar a amostra antes de iniciar antibióticos influencia bastante a positividade¹⁾
Escolha um dos cinco métodos de coloração (Giemsa, Gram, Fungiflora Y®, método de anticorpo fluorescente, coloração de Hansel) de acordo com o objetivo.
O teste de eosinófilos (coloração de Hansel) confirma a doença conjuntival alérgica ao identificar até mesmo um único eosinófilo²⁾
Raspe a área de transição entre a lesão e o tecido normal com uma espátula de Kimura ou uma faca de golfe e colete a amostra com um swab de fibra sintética.
Mesmo com cultura positiva, pode não ser possível determinar o agente causador. A decisão deve ser feita de forma abrangente com base no esfregaço, nos achados oculares, na sensibilidade aos medicamentos e na resposta ao tratamento.
No diagnóstico de ceratite infecciosa, a microscopia de esfregaço e a cultura são fortemente recomendadas (nível de evidência: C)¹⁾

1. O que são citologia e cultura de raspado conjuntival

A citologia do raspado conjuntival e a cultura microbiana são exames usados para identificar o agente causador nas doenças oculares infecciosas, realizar teste de sensibilidade aos medicamentos e confirmar eosinófilos na doença conjuntival alérgica (diagnóstico definitivo). Ao identificar precocemente o agente causador e escolher um antibiótico eficaz, pode-se esperar melhora dos sinais de infecção.

As Diretrizes para Diagnóstico e Tratamento da Ceratite Infecciosa (3ª edição) recomendam fortemente realizar microscopia de esfregaço e cultura quando houver suspeita de ceratite infecciosa (nível de evidência: C)¹⁾. Esses exames são considerados essenciais, especialmente em casos de ceratite urgente ou endoftalmite, ou quando se suspeita da presença de um agente causador incomum.

Nas Diretrizes para Diagnóstico e Tratamento da Doença Conjuntival Alérgica (3ª edição), o teste de eosinófilos (coloração de Hansel) é claramente descrito como base para o diagnóstico definitivo, e é um exame indispensável para transformar um diagnóstico clínico em diagnóstico definitivo²⁾.

Indicações

Quando se suspeita de doença infecciosa

Ceratite e conjuntivite bacterianas (especialmente urgentes)
Conjuntivite gonocócica (o diagnóstico precoce é importante porque pode causar perfuração corneana)
Ceratite por Acanthamoeba (o cultivo é difícil em serviços gerais, portanto recomenda-se o exame microscópico)
Ceratite fúngica
Casos em que se suspeita de um agente causador especial (como ceratite refratária ou resistente ao tratamento)

Diagnóstico definitivo de doenças oculares alérgicas

Conjuntivite alérgica (diagnóstico definitivo por exame de eosinófilos)
Ceratoconjuntivite vernal (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
Ceratoconjuntivite atópica (atopic keratoconjunctivitis: AKC)

Q Em que casos se realiza o exame de raspado conjuntival?

É realizado principalmente com dois objetivos. Primeiro, quando há suspeita de ceratite infecciosa ou conjuntivite; é um exame indispensável, especialmente em infecções urgentes como ceratite e endoftalmite, ou quando se suspeitam agentes causadores especiais como gonococo, Acanthamoeba ou fungos. Segundo, para confirmar a doença conjuntival alérgica; se for identificado até mesmo 1 eosinófilo na coloração de Hansel, o diagnóstico fica confirmado. Os achados clínicos isoladamente permitem apenas um diagnóstico clínico, por isso o exame de eosinófilos é feito quando é necessário um diagnóstico definitivo.

2. Técnica de coleta da amostra

O princípio é coletar bem a amostra da área onde se suspeita que o agente causador esteja presente. O momento da coleta afeta muito a taxa de positividade. A taxa de positividade da cultura antes do uso de antibióticos é de 77,3%, enquanto após o tratamento cai para 37,8% ¹⁾. Certifique-se de coletar a amostra antes de administrar antibióticos.

Preparo e procedimento

Anestesia: Use anestesia em colírio. É preferível uma formulação sem conservantes (para evitar o efeito dos conservantes sobre os microrganismos)
Instrumento de coleta: espátula de Kimura ou faca de golfe (para raspagem da conjuntiva e da córnea). Ou um swab de fibra sintética
Local de coleta: raspe a área de transição entre a lesão e o tecido normal. Como há bactérias na borda entre a área inflamada e a córnea normal, essa zona de transição é a mais adequada
Prevenção do ressecamento: ao coletar com swab, umedeça-o previamente com solução salina estéril. O ressecamento reduz a qualidade da amostra
Material do swab: use material de fibra sintética. Materiais naturais podem afetar o crescimento de microrganismos e o método de exame

Cuidados

Em alguns casos, a lesão é extremamente frágil. Não raspe com força
Há relatos de que a taxa de positividade da cultura ao raspar a lesão com swab é de cerca de 50%, e de 35% com agulha 23G ¹⁾
Se a quantidade de amostra for pequena, indique claramente ao laboratório a prioridade dos exames

Q Quais são os cuidados na coleta da amostra?

O mais importante é coletar antes de administrar antibióticos. Após o uso de antibióticos, a taxa de positividade da cultura cai acentuadamente de 77,3% para 37,8%. O local da coleta deve ser a região de transição entre a lesão e o tecido normal; raspe a borda, não o centro da inflamação. Umedeça previamente o swab com soro fisiológico estéril para evitar ressecamento. Use um swab de fibra sintética ou uma espátula de Kimura ou faca de golfe, e faça o procedimento sob anestesia tópica. Se a lesão for frágil, não raspe com força.

3. Esfregaço e exame microscópico (métodos de coloração e interpretação)

Avaliação da densidade de células caliciformes por citologia de impressão conjuntival (coloração PAS-hematoxilina)

Usuba FS, de Medeiros-Ribeiro AC, Novaes P, et al. Dry eye in rheumatoid arthritis patients under TNF-inhibitors: conjunctival goblet cell as an early ocular biomarker. Sci Rep. 2020;10:14054. Figure 2. PMCID: PMC7441175. License: CC BY.

Imagem representativa da citologia de impressão conjuntival (IC) com coloração PAS-hematoxilina. (A) Basal: grau 2 da classificação de Nelson (100–350 cells/mm², anormal), (B) após 12 meses de tratamento com inibidor de TNF: grau 0 (>500 cells/mm², normal). Corresponde às alterações morfológicas das células epiteliais conjuntivais e das células caliciformes avaliadas pelo esfregaço e exame microscópico, incluindo a coloração de Giemsa, abordados na seção ‘3. Esfregaço e exame microscópico (métodos de coloração e interpretação)’.

A amostra coletada é espalhada em uma lâmina de vidro, corada e observada ao microscópio óptico. A taxa de positividade do esfregaço microscópico é relatada como 58,1–73,7%¹⁾.

Etapas de preparo da amostra

Limpe a lâmina de vidro com álcool e marque pelo verso a área de espalhamento da amostra com um lápis de diamante ou marcador
Espalhe o material em uma camada fina, distribuindo-o suavemente. No caso do swab, se a quantidade de amostra for pequena, espalhe pressionando levemente como se estivesse carimbando; se houver quantidade suficiente, espalhe rolando
Fixe com álcool metílico ou pela chama

Seleção do método de coloração

Escolha entre cinco métodos de coloração de acordo com o objetivo.

Coloração de Giemsa (Diff-Quik™): método de coloração versátil usado na triagem, incluindo causas infecciosas e não infecciosas. Com o kit de coloração rápida (Diff-Quik™), obtém-se em cerca de 15 segundos uma coloração equivalente ao método convencional. Todos os microrganismos ficam azuis, mas não é possível distinguir entre Gram-positivos e Gram-negativos¹⁾
Coloração de Gram: método de coloração especializado em infecções bacterianas. Permite distinguir bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e confirmar a morfologia bacteriana (cocos ou bacilos). Com Faver G (Nissui Pharmaceutical), pode ser concluído em cerca de 3 minutos¹⁾
Coloração FungiFloraY®: corante fluorescente do tipo ácido estilbenossulfônico. Cora seletivamente os polissacarídeos com ligações β (quitina e celulose) e detecta com alta sensibilidade fungos (hifas e leveduras) e cistos de Acanthamoeba. É necessária observação em microscópio de fluorescência¹⁾
Imunofluorescência: demonstra diretamente antígenos virais como HSV (vírus herpes simples) e VZV (vírus varicela-zóster)¹⁾
Coloração de Hansel: coloração específica usada para detectar eosinófilos em doenças conjuntivais alérgicas

Ampliação da microscopia

400x: usado para identificar o tipo de células inflamatórias (os neutrófilos têm cerca de 12–15 μm de diâmetro). Nas infecções bacterianas, predominam os neutrófilos; nas infecções virais, predominam os linfócitos
1000x com imersão em óleo: usado para observar os microrganismos (as bactérias têm cerca de 1,0 μm de diâmetro)

Métodos de coloração e achados característicos por patógeno

Patógeno suspeito	Corante recomendado	Achados característicos
Bactérias (geral)	Coloração de Gram	Cocos e bacilos Gram-positivos/Gram-negativos
Gonococo	Diff-Quik™	Diplococos em forma de grão de café; dentro de neutrófilos
Fungos	Fungiflora Y®	Hifas e conídios (fluorescentes)
Acanthamoeba	Fungiflora Y®	Cistos de parede dupla (cerca de 10×10 μm)
Vírus (como o HSV)	Método de anticorpo fluorescente	Fluorescência específica em células infectadas
Eosinófilos (alergia)	Corante de Hansel	Positivo mesmo com apenas 1 eosinófilo

4. Exame de cultura

No exame de cultura, o microrganismo causador é cultivado em meio de cultura, permitindo sua identificação e o teste de sensibilidade aos medicamentos. A taxa de cultura positiva varia conforme a instituição e as condições, de 37,6% a 74,3% ¹⁾. Como há flora normal na superfície ocular externa, a bactéria isolada nem sempre é a causadora. A avaliação deve ser feita de forma abrangente com base nos achados da microscopia, nos achados oculares, na sensibilidade aos medicamentos e na resposta ao tratamento.

Principais tipos de meio de cultura

Meio de cultura	Micro-organismo-alvo	Condições de cultura
meio de ágar sangue	bactérias comuns (permite avaliar a hemólise)	37°C, aeróbio
meio de ágar chocolate	Haemophilus e gonococos (contém fatores V e X)	37°C, CO2
meio Sabouraud/de dextrose de batata	fungos	cultivado em duas condições: 37°C e temperatura ambiente
placa de ágar NN a 1,5%	Acanthamoeba	30°C
Meio de transporte (Seed Swab®, Transwab®, etc.)	Bactérias comuns (quando o serviço não tem meio sólido)	Transporte à temperatura ambiente (taxa de positividade 50–69%)¹⁾

Armazenamento da amostra

A forma de armazenar a amostra quando houver demora para enviá-la ao laboratório depende do tipo de microrganismo causador.

Bactérias comuns: Armazenar a 4°C (geladeira)
Gonococos e meningococos: Armazenar em temperatura ambiente, pois são sensíveis ao frio e morrem com facilidade
Se houver suspeita de bactérias anaeróbias obrigatórias: Armazenar em recipiente de transporte anaeróbio

Pontos importantes ao solicitar o exame

Informe claramente no pedido os achados clínicos e o microrganismo-alvo. A adição de meios seletivos melhora a taxa de detecção
Se a quantidade de amostra for pequena, indique a prioridade dos exames (por exemplo, cultura > microscopia, bactérias > fungos)

Interpretação do teste de sensibilidade a medicamentos

Nos testes de sensibilidade, costuma-se escolher o fármaco com MIC (concentração inibitória mínima) mais baixa entre os classificados como S (sensível). No entanto, mesmo quando classificado como R (resistente), ele pode ser clinicamente eficaz, portanto é necessária uma avaliação global. Observe que, para os testes de sensibilidade de fungos e Acanthamoeba, os critérios de interpretação ainda não estão estabelecidos ¹⁾.

Q Se não forem detectados microrganismos na cultura, como deve ser interpretado?

A taxa de positividade da cultura é de 37.6–74.3%, e um resultado negativo não exclui infecção. O fator que mais influencia é o momento da coleta da amostra; quando coletada após o uso de antimicrobianos, a taxa de positividade cai para cerca de metade. Além disso, a taxa de positividade da cultura em casos com esfregaço negativo é de 42.7–47.1%, e em casos com esfregaço positivo é de 57.1–82.4%, de modo que a combinação dos dois testes melhora a precisão diagnóstica. Como a Acanthamoeba é difícil de isolar e cultivar em serviços gerais, deve-se priorizar a microscopia com coloração Diff-Quik™ para confirmar a estrutura de parede dupla do cisto.

5. Exame de eosinófilos (diagnóstico definitivo da doença conjuntival alérgica)

Coloração de Giemsa do tecido conjuntival na conjuntivite alérgica (infiltração de eosinófilos)

Kimura M, Ando T, Kume Y, et al. A nerve-goblet cell association promotes allergic conjunctivitis through rapid antigen passage. JCI Insight. 2023;8(21):e168596. Figure 1. PMCID: PMC10721269. License: CC BY.

Coloração de Giemsa do tecido conjuntival em um modelo de conjuntivite alérgica (×200). As setas indicam eosinófilos, e a imagem ampliada (barra de escala de 10 μm) mostra a morfologia celular característica com núcleos bilobados e grânulos eosinofílicos. Isso corresponde à detecção de eosinófilos na doença conjuntival alérgica discutida na seção 5, Exame de eosinófilos (diagnóstico definitivo da doença conjuntival alérgica), no texto principal.

Para um diagnóstico definitivo da doença conjuntival alérgica, os eosinófilos devem ser detectados em um esfregaço de raspado conjuntival corado com Hansel ²⁾.

Técnica de coleta

Após anestesia tópica, evert a pálpebra superior
Massageie suavemente a conjuntiva palpebral com uma haste de vidro e recolha o muco acumulado na superfície conjuntival com pinça ou espátula
Faça o esfregaço em uma lâmina, realize a coloração de Hansel e observe ao microscópio óptico

Interpretação

Se ao microscópio puder ser identificado até mesmo um eosinófilo, o resultado é considerado positivo e isso leva ao diagnóstico definitivo da doença alérgica conjuntival²⁾. Se houver sangramento durante a coleta, eosinófilos do sangue podem se misturar à amostra, por isso deve-se repetir o exame no outro olho.

Sistema de diagnóstico da doença alérgica conjuntival

As três etapas diagnósticas com base no Guia de Prática Clínica da Doença Alérgica Conjuntival (3ª edição) são as seguintes²⁾.

Categoria diagnóstica	Critérios necessários
Diagnóstico clínico	Apenas achados clínicos (sintomas e sinais alérgicos)
Diagnóstico clínico definitivo	Achados clínicos + confirmação de predisposição alérgica (IgE total lacrimal positivo, teste cutâneo, IgE sérica específica para o antígeno positiva)
Diagnóstico definitivo	Achados clínicos + teste de eosinófilos positivo (confirmação de reação alérgica local ocular)

O diagnóstico clínico definitivo apenas confirma uma predisposição alérgica sistêmica e não comprova diretamente uma reação alérgica no próprio olho. Só quando o teste de eosinófilos comprova diretamente uma reação alérgica local ocular é que se considera diagnóstico definitivo²⁾.

6. Interpretação dos resultados dos exames e avaliação global

Estimativa do patógeno pelo tipo de células inflamatórias

Mesmo quando não se encontram microrganismos, o tipo de células inflamatórias pode dar pistas sobre o patógeno provável.

Predomínio de neutrófilos → sugere infecção bacteriana
Predomínio de linfócitos → sugere infecção viral
Predomínio de eosinófilos → sugere infecção alérgica ou parasitária

Avaliação global do agente causador

Se o microrganismo isolado é ou não o agente causador deve ser julgado de forma abrangente.

Compatibilidade entre o achado microscópico e o microrganismo isolado na cultura (se o microrganismo visto na microscopia coincide com o que cresceu na cultura)
Compatibilidade com os achados oculares (se a amostra foi colhida da lesão)
Compatibilidade entre os resultados do teste de sensibilidade aos medicamentos e o efeito real do tratamento

Atenção a patógenos especiais

gonococo: é vulnerável ao ressecamento e às mudanças de temperatura, morrendo facilmente. O processamento imediato após a coleta é essencial. O armazenamento refrigerado é inadequado (manter em temperatura ambiente)
Acanthamoeba: o isolamento e a cultura são difíceis em serviços gerais. Com a coloração Dif-Quik™, deve-se priorizar a confirmação de cistos com parede dupla

Combinação de microscopia de esfregaço e cultura

Mesmo em casos com microscopia de esfregaço negativa, a taxa de positividade da cultura pode chegar a 42,7–47,1%¹⁾. Por outro lado, em casos com esfregaço positivo, a taxa de positividade da cultura é de 57,1–82,4%, e fazer os dois exames ao mesmo tempo aumenta a sensibilidade. O exame de PCR é útil como apoio à microscopia de esfregaço e à cultura, mas não se recomenda diagnosticar ceratite bacteriana apenas com PCR¹⁾.

7. Pesquisas mais recentes e perspectivas futuras

Análise metagenômica (sequenciamento de nova geração): está se tornando possível analisar de forma abrangente o microbioma da superfície ocular, inclusive microrganismos que não podem ser cultivados. Espera-se detectar patógenos que não podem ser identificados com os exames de cultura tradicionais
PCR multiplex: o desenvolvimento de sistemas que detectam de forma rápida e simultânea vários patógenos (bactérias, fungos, vírus e Acanthamoeba) em um único exame está avançando. Espera-se melhorar a precisão e a velocidade do diagnóstico de ceratite infecciosa³⁾
Espectrometria de massa MALDI-TOF: técnica de espectrometria de massa que consegue identificar bactérias cultivadas em apenas alguns minutos. Em comparação com os métodos bioquímicos convencionais, pode reduzir bastante o tempo, e sua aplicação em infecções oculares está sendo estudada⁴⁾
Aprimoramento da sensibilidade e especificidade do exame de eosinófilos: está em desenvolvimento uma forma de detecção de eosinófilos de alta sensibilidade usando microscopia eletrônica e anticorpos marcados com fluorescência. A coloração de Hansel convencional tem limites na sensibilidade de detecção, e, se um método mais sensível for estabelecido, a precisão diagnóstica poderá melhorar

8. Referências

日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.