Цитологическое исследование и посев с конъюнктивы (анализ на инфекцию и аллергию)

Цитология и посев соскоба конъюнктивы используются для выявления возбудителя при инфекционных заболеваниях глаз, определения чувствительности к препаратам и подтверждения аллергического заболевания конъюнктивы.
Положительность микроскопии мазка составляет 58,1–73,7%, а посева — 37,6–74,3%; забор материала до начала антибиотиков существенно влияет на частоту положительных результатов¹⁾
В зависимости от цели выбирают один из пяти методов окраски (по Гимзе, по Граму, Fungiflora Y®, метод флуоресцентных антител, окраска по Ханзелю).
Исследование эозинофилов (окраска по Ханзелю) позволяет подтвердить аллергическое заболевание конъюнктивы уже при обнаружении даже одного эозинофила²⁾
Границу между очагом и нормальной тканью соскабливают шпателем Кимуры или гольф-ножом, а материал берут тампоном из синтетического волокна.
Даже при положительном посеве не всегда удается точно определить возбудителя. Решение принимают комплексно, с учетом данных мазка, глазных находок, чувствительности к препаратам и эффекта лечения.
При диагностике инфекционного кератита настоятельно рекомендуется микроскопия мазка и посев (уровень доказательности: C)¹⁾

1. Что такое цитология и посев соскоба конъюнктивы

Цитология соскоба конъюнктивы и микробиологический посев — это исследования, которые используют для выявления возбудителя при инфекционных заболеваниях глаз, определения чувствительности к препаратам и подтверждения эозинофилов при аллергическом заболевании конъюнктивы (окончательный диагноз). При раннем выявлении возбудителя и подборе эффективного антибиотика можно ожидать улучшения признаков инфекции.

В «Руководстве по диагностике и лечению инфекционного кератита» (3-е издание) настоятельно рекомендуется выполнять микроскопию мазка и посев при подозрении на инфекционный кератит (уровень доказательности: C)¹⁾. Особенно это считается обязательным исследованием при неотложном кератите или эндофтальмите, а также при подозрении на необычного возбудителя.

В «Руководстве по диагностике и лечению аллергического заболевания конъюнктивы» (3-е издание) исследование эозинофилов (окраска по Ханзелю) прямо указано как основа окончательного диагноза и является незаменимым методом для перевода клинического диагноза в окончательный²⁾.

Показания

При подозрении на инфекционное заболевание

Бактериальный кератит и конъюнктивит (особенно неотложные случаи)
Гонококковый конъюнктивит (ранняя диагностика важна, так как он может привести к перфорации роговицы)
Акантамёбный кератит (в обычных учреждениях посев выполнить трудно, поэтому рекомендуется микроскопическое исследование)
Грибковый кератит
Случаи, когда подозревают особый возбудитель (например, упорный или резистентный к лечению кератит)

Подтверждённая диагностика аллергических заболеваний глаз

Аллергический конъюнктивит (подтверждение диагноза по исследованию эозинофилов)
Весенний кератоконъюнктивит (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
Атопический кератоконъюнктивит (atopic keratoconjunctivitis: AKC)

Q В каких случаях проводят соскоб конъюнктивы?

Его выполняют главным образом с двумя целями. Во-первых, при подозрении на инфекционный кератит или конъюнктивит; особенно это необходимое исследование при неотложных инфекциях, таких как кератит и эндофтальмит, а также при подозрении на особые возбудители, такие как гонококк, Acanthamoeba или грибки. Во-вторых, для подтверждения аллергического заболевания конъюнктивы; если при окраске по Hansel обнаруживается хотя бы один эозинофил, диагноз считается подтвержденным. Только клинические признаки позволяют поставить лишь клинический диагноз, поэтому при необходимости точного подтверждения выполняют исследование на эозинофилы.

2. Методика забора материала

Основной принцип — тщательно брать материал из участка, где предполагается наличие возбудителя. Время забора сильно влияет на долю положительных результатов. Положительность посева до начала антибиотикотерапии составляет 77,3%, тогда как после лечения снижается до 37,8% ¹⁾. Образец обязательно нужно взять до назначения антибиотиков.

Подготовка и порядок выполнения

Анестезия: Используют анестезию в виде глазных капель. Предпочтительнее препарат без консервантов (чтобы избежать влияния консервантов на микроорганизмы)
Инструмент для забора: шпатель Кимуры или гольф-нож (для соскоба конъюнктивы и роговицы). Либо ватный тампон из синтетического волокна
Место забора: соскабливают пограничную зону между очагом и нормальной тканью. Поскольку микробы находятся на границе между воспалённым участком и нормальной роговицей, именно эта пограничная зона наиболее подходит
Предотвращение высыхания: при заборе тампоном заранее смочите тампон стерильным физиологическим раствором. Высыхание снижает качество образца
Материал тампона: используйте тампоны из синтетического волокна. Натуральные материалы могут влиять на рост микроорганизмов и метод исследования

Меры предосторожности

В некоторых случаях очаг очень хрупкий. Не соскребайте его с усилием
Сообщалось, что положительность посева при соскобе очага тампоном составляет около 50%, а при использовании иглы 23G — 35% ¹⁾
Если объем образца мал, четко укажите лаборатории приоритет исследований

Q На что следует обратить внимание при взятии образца?

Самое важное — брать образец до назначения антибиотиков. После назначения антибиотиков частота положительных культур резко снижается с 77,3% до 37,8%. Место взятия должно быть на границе между очагом и нормальной тканью; соскребают не центр воспаления, а его край. Тампон предварительно смачивают стерильным физиологическим раствором, чтобы он не высыхал. Используйте тампон из синтетического волокна или шпатель Kimura или golf knife, и выполняйте процедуру под местной анестезией. Если очаг хрупкий, не соскребайте его с силой.

3. Мазок и микроскопическое исследование (методы окраски и оценка)

Оценка плотности бокаловидных клеток методом конъюнктивальной импрессионной цитологии (окраска PAS-гематоксилином)

Usuba FS, de Medeiros-Ribeiro AC, Novaes P, et al. Dry eye in rheumatoid arthritis patients under TNF-inhibitors: conjunctival goblet cell as an early ocular biomarker. Sci Rep. 2020;10:14054. Figure 2. PMCID: PMC7441175. License: CC BY.

Типичное изображение конъюнктивальной импрессионной цитологии (IC) с окраской PAS-гематоксилином. (A) Исходно: степень 2 по классификации Nelson (100–350 cells/mm², аномально), (B) после 12 месяцев лечения ингибитором TNF: степень 0 (>500 cells/mm², норма). Соответствует морфологическим изменениям клеток эпителия конъюнктивы и бокаловидных клеток, оцениваемым при мазке и микроскопическом исследовании, включая окраску по Гимзе, которые описаны в разделе «3. Мазок и микроскопическое исследование (методы окраски и оценка)».

Полученный образец наносят на предметное стекло, окрашивают и рассматривают под световым микроскопом. Сообщается, что частота положительных результатов мазка и микроскопии составляет 58,1–73,7%¹⁾.

Порядок приготовления препарата

Протрите предметное стекло спиртом и отметьте с обратной стороны область нанесения образца алмазным карандашом или маркером
Тонко распределите материал, осторожно размазывая его. При использовании тампона, если образца мало, наносите его легким нажатием, как штампом; если его достаточно, наносите прокатыванием
Зафиксируйте метиловым спиртом или пламенем

Выбор метода окраски

Выбирают из пяти методов окрашивания в зависимости от цели.

Окраска по Гимзе (Diff-Quik™): универсальный метод окрашивания, используемый для скрининга, в том числе при инфекционных и неинфекционных причинах. С помощью набора для быстрой окраски (Diff-Quik™) можно получить окрашивание, сопоставимое с традиционным методом, примерно за 15 секунд. Все микроорганизмы окрашиваются в синий цвет, но грамположительные и грамотрицательные бактерии различить нельзя¹⁾
Окраска по Граму: метод окрашивания, специально предназначенный для бактериальных инфекций. Он позволяет различать грамположительные и грамотрицательные бактерии и оценивать форму бактерий (кокки или палочки). При использовании Faver G (Nissui Pharmaceutical) процедура занимает около 3 минут¹⁾
Окраска FungiFloraY®: флуоресцентный краситель на основе стилбенсульфоновой кислоты. Он избирательно окрашивает β-связанные полисахариды (хитин и целлюлозу) и чувствительно выявляет грибы (гифы и дрожжи) и цисты акантамёбы. Необходим просмотр в люминесцентном микроскопе¹⁾
Иммунофлюоресценция: напрямую выявляет вирусные антигены, такие как HSV (вирус простого герпеса) и VZV (вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса)¹⁾
Окраска по Ханзелу: специальная окраска, используемая для выявления эозинофилов при аллергических заболеваниях конъюнктивы

Увеличение при микроскопии

400-кратное увеличение: используется для определения типа воспалительных клеток (диаметр нейтрофилов составляет около 12–15 мкм). При бактериальной инфекции преобладают нейтрофилы, при вирусной инфекции — лимфоциты
1000-кратное увеличение с иммерсией в масле: используется для наблюдения микроорганизмов (диаметр бактерий составляет около 1,0 мкм)

Методы окраски и характерные признаки по возбудителю

Предполагаемый возбудитель	Рекомендуемая окраска	Характерные признаки
Бактерии (в целом)	Окраска по Граму	Грамположительные/грамотрицательные кокки и палочки
Гонококк	Diff-Quik™	Диплококки в форме кофейного зерна; внутри нейтрофилов
Грибы	Fungiflora Y®	Гифы и конидии (флуоресценция)
Acanthamoeba	Fungiflora Y®	Кисты с двойной стенкой (около 10×10 мкм)
Вирусы (например, HSV)	Метод флуоресцентных антител	Специфическая флуоресценция в инфицированных клетках
Эозинофилы (аллергия)	Окраска Ханселя	Положительно даже при наличии всего 1 эозинофила

4. Культуральное исследование

При культуральном исследовании возбудителя выращивают на питательной среде, что позволяет выполнить его идентификацию и тест на чувствительность к препаратам. Частота положительных результатов посева варьирует в зависимости от учреждения и условий и составляет 37,6–74,3% ¹⁾. Поскольку на наружной поверхности глаза присутствует нормальная флора, выделенный микроорганизм не обязательно является причиной инфекции. Оценку проводят комплексно с учетом результатов микроскопии, глазных находок, чувствительности к препаратам и ответа на лечение.

Основные виды питательных сред

Питательная среда	Целевой микроорганизм	Условия культивирования
кровяной агар	обычные бактерии (можно оценить гемолиз)	37°C, аэробные условия
шоколадный агар	Haemophilus и гонококки (содержит факторы V и X)	37°C, CO2
среда Сабуро/картофельно-декстрозная среда	грибы	культивирование в двух условиях: 37°C и комнатная температура
1,5% NN агаровая пластина	Acanthamoeba	30°C
Транспортная среда (Seed Swab®, Transwab® и т. д.)	Обычные бактерии (если в учреждении нет плотной среды)	Транспортировка при комнатной температуре (положительность 50–69%)¹⁾

Хранение образца

Способ хранения образца, если его доставка в лабораторию займет время, зависит от типа возбудителя.

Обычные бактерии: хранить при 4°C (в холодильнике)
Гонококки и менингококки: хранить при комнатной температуре, так как они чувствительны к холоду и легко погибают
При подозрении на облигатные анаэробы: хранить в анаэробном транспортном контейнере

Важные моменты при назначении исследования

В направлении четко укажите клинические данные и целевой микроорганизм. Добавление селективных сред повышает выявляемость
Если количество образца небольшое, укажите приоритет исследований (например: посев > микроскопия, бактерии > грибы)

Интерпретация теста на чувствительность к препаратам

При тестировании чувствительности обычно выбирают препарат с более низким MIC (минимальной подавляющей концентрацией) среди тех, которые оценены как S (чувствительный). Однако даже если препарат оценён как R (резистентный), он может быть клинически эффективен, поэтому требуется комплексная оценка. Следует учитывать, что для тестов чувствительности грибов и Acanthamoeba критерии интерпретации не установлены ¹⁾.

Q Как следует оценивать ситуацию, если при культуральном исследовании микроорганизмы не выявлены?

Показатель положительных культур составляет 37.6–74.3%, и отрицательный результат не исключает инфекцию. Наиболее важный фактор — время забора образца; при заборе после назначения антимикробных препаратов показатель положительных результатов снижается примерно вдвое. Кроме того, частота положительных культур при отрицательном мазке составляет 42.7–47.1%, а при положительном мазке — 57.1–82.4%, поэтому сочетание обоих тестов повышает точность диагностики. Поскольку Acanthamoeba трудно выделить и культивировать в обычных учреждениях, приоритет следует отдавать микроскопическому исследованию с окраской Diff-Quik™ для подтверждения двустенной структуры цисты.

5. Исследование эозинофилов (окончательный диагноз аллергического конъюнктивального заболевания)

Окраска Гимза ткани конъюнктивы при аллергическом конъюнктивите (инфильтрация эозинофилов)

Kimura M, Ando T, Kume Y, et al. A nerve-goblet cell association promotes allergic conjunctivitis through rapid antigen passage. JCI Insight. 2023;8(21):e168596. Figure 1. PMCID: PMC10721269. License: CC BY.

Окраска Гимза ткани конъюнктивы в модели аллергического конъюнктивита (×200). Стрелки указывают на эозинофилы, а увеличенное изображение (масштаб 10 мкм) показывает характерную форму клетки с двулопастным ядром и эозинофильными гранулами. Это соответствует выявлению эозинофилов при аллергическом конъюнктивальном заболевании, описанному в разделе 5, Исследование эозинофилов (окончательный диагноз аллергического конъюнктивального заболевания), основного текста.

Для окончательного диагноза аллергического конъюнктивального заболевания необходимо выявить эозинофилы в мазке соскоба конъюнктивы, окрашенном по Ханселю ²⁾.

Техника забора

После местной анестезии вывернуть верхнее веко
Осторожно массировать пальпебральную конъюнктиву стеклянной палочкой и собрать слизь, скопившуюся на поверхности конъюнктивы, пинцетом или шпателем
Нанести на предметное стекло, выполнить окраску по Ханселю и наблюдать под световым микроскопом

Интерпретация

Если под микроскопом удается обнаружить хотя бы один эозинофил, результат считают положительным, и это означает окончательный диагноз аллергического заболевания конъюнктивы²⁾. Если при взятии материала было кровотечение, в образец могут попасть эозинофилы из крови, поэтому исследование проводят повторно на другом глазу.

Система диагностики аллергического заболевания конъюнктивы

Три этапа диагностики на основе Руководства по клинической практике при аллергическом заболевании конъюнктивы (3-е издание) следующие²⁾.

Диагностическая категория	Необходимые условия
Клинический диагноз	Только клинические признаки (аллергические симптомы и признаки)
Клинически подтвержденный диагноз	Клинические признаки + подтверждение аллергической предрасположенности (положительный общий IgE в слезе, кожная проба, положительный сывороточный аллерген-специфический IgE)
Окончательный диагноз	Клинические признаки + положительный тест на эозинофилы (подтверждение местной аллергической реакции в глазу)

Клинически подтвержденный диагноз лишь подтверждает системную аллергическую предрасположенность и не доказывает напрямую аллергическую реакцию в самом глазу. Только когда тест на эозинофилы напрямую подтверждает местную аллергическую реакцию в глазу, диагноз считается окончательным²⁾.

6. Интерпретация результатов обследования и общая оценка

Определение возбудителя по типу воспалительных клеток

Даже если бактерии не обнаружены, тип воспалительных клеток может подсказать вероятного возбудителя.

Преобладание нейтрофилов → указывает на бактериальную инфекцию
Преобладание лимфоцитов → указывает на вирусную инфекцию
Преобладание эозинофилов → указывает на аллергическую или паразитарную инфекцию

Общая оценка возбудителя

Является ли выделенный микроорганизм возбудителем, оценивают комплексно.

Соответствие между результатом микроскопии и выделенным при посеве микроорганизмом (совпадает ли микроорганизм, увиденный при микроскопии, с тем, что вырос в культуре)
Соответствие глазным данным (был ли образец взят из очага поражения)
Соответствие результатов теста на чувствительность к препаратам и фактического эффекта лечения

Внимание к особым возбудителям

гонококк: чувствителен к высыханию и изменениям температуры, поэтому легко погибает. Обработка сразу после взятия образца обязательна. Хранение в холодильнике не подходит (хранить при комнатной температуре)
акантамёба: выделение и культивирование в обычных учреждениях затруднены. При окраске Dif-Quik™ приоритет следует отдавать подтверждению цист с двойной стенкой

Сочетание микроскопии мазка и культурального исследования

Даже в случаях с отрицательным результатом микроскопии мазка частота положительной культуры может достигать 42,7–47,1%¹⁾. С другой стороны, в случаях с положительным мазком частота положительной культуры составляет 57,1–82,4%, и одновременное выполнение обоих исследований повышает чувствительность. ПЦР-исследование полезно как дополнение к микроскопии мазка и культуре, но диагностировать бактериальный кератит только по ПЦР не рекомендуется¹⁾.

7. Новейшие исследования и перспективы на будущее

Метагеномный анализ (секвенирование нового поколения): становится возможным комплексный анализ микробиома поверхности глаза, включая некультивируемые микроорганизмы. Ожидается выявление патогенов, которые не удаётся определить традиционными культуральными методами
Мультиплексная ПЦР: идёт разработка систем, способных быстро и одновременно выявлять несколько патогенов (бактерии, грибы, вирусы и акантамёбу) за одно исследование. Ожидается повышение точности и скорости диагностики инфекционного кератита³⁾
Масс-спектрометрия MALDI-TOF: метод масс-спектрометрии, позволяющий идентифицировать культивированные бактерии всего за несколько минут. По сравнению с традиционными биохимическими методами идентификации он значительно сокращает время, и его применение в офтальмологических инфекциях изучается⁴⁾
Уточнение чувствительности и специфичности исследования эозинофилов: идёт разработка высокочувствительных методов выявления эозинофилов с использованием электронной микроскопии и флуоресцентно-меченых антител. Традиционная окраска Ханселя имеет ограничения по чувствительности выявления, и если будет создан более чувствительный метод, точность диагностики может повыситься

8. Список литературы

日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.