Konjonktiva sitolojisi ve kültürü (enfeksiyon ve alerji testleri)
1. Konjonktival kazıntı sitolojisi ve kültürü nedir
Section titled “1. Konjonktival kazıntı sitolojisi ve kültürü nedir”Konjonktival kazıntı sitolojisi ve mikrobiyal kültür, enfeksiyöz göz hastalıklarında etken mikroorganizmayı saptamak, ilaç duyarlılık testi yapmak ve alerjik konjonktival hastalıkta eozinofilleri doğrulamak (kesin tanı) için kullanılan testlerdir. Etken mikroorganizma erken saptanır ve etkili bir antibiyotik seçilirse, enfeksiyon bulgularında iyileşme beklenebilir.
Enfeksiyöz Keratit Tanı ve Tedavi Kılavuzu (3. baskı), enfeksiyöz keratit düşünüldüğünde sürüntü mikroskopisi ve kültür yapılmasını güçlü şekilde önerir (kanıt düzeyi: C)1). Özellikle acil keratit veya endoftalmit durumlarında ya da alışılmadık bir etken mikroorganizma düşünülüyorsa bu testler zorunlu kabul edilir.
Alerjik Konjonktival Hastalık Tanı ve Tedavi Kılavuzu (3. baskı), eozinofil testini (Hansel boyası) kesin tanının temeli olarak açıkça belirtir ve klinik tanıyı kesin tanıya yükseltmek için vazgeçilmez bir testtir2).
Endikasyonlar
Section titled “Endikasyonlar”Enfeksiyöz bir hastalıktan şüphelenildiğinde
Section titled “Enfeksiyöz bir hastalıktan şüphelenildiğinde”- Bakteriyel keratit ve konjonktivit (özellikle acil durumlarda)
- Gonokok konjonktiviti (kornea perforasyonuna yol açabileceği için erken tanı önemlidir)
- Acanthamoeba keratiti (genel merkezlerde kültür zordur; bu nedenle mikroskobik inceleme önerilir)
- Fungal keratit
- Özel bir etkenin düşünüldüğü olgular (örneğin dirençli veya tedaviye yanıtsız keratit)
Alerjik göz hastalıklarının kesin tanısı
Section titled “Alerjik göz hastalıklarının kesin tanısı”- Alerjik konjonktivit (eozinofil incelemesi ile kesin tanı)
- Vernal keratokonjonktivit (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Atopik keratokonjonktivit (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Başlıca iki amaçla yapılır. Birincisi, enfeksiyöz keratit veya konjonktivit şüphesi olduğunda; özellikle keratit ve endoftalmit gibi acil enfeksiyonlarda ya da gonokok, Acanthamoeba veya mantar gibi özel etkenler düşünülüyorsa vazgeçilmez bir incelemedir. İkincisi, alerjik konjonktiva hastalığını doğrulamak içindir; Hansel boyasında tek bir eozinofil bile görülürse kesin tanı konur. Yalnızca klinik bulgularla sadece klinik tanı konulabilir, bu yüzden kesin tanı gerektiğinde eozinofil incelemesi yapılır.
2. Örnek alma tekniği
Section titled “2. Örnek alma tekniği”İlke, etken mikroorganizmanın bulunduğundan şüphelenilen bölgeden örneği iyi şekilde almaktır. Örnek alma zamanı pozitiflik oranını büyük ölçüde etkiler. Antibiyotik öncesi kültür pozitiflik oranı %77,3 iken, tedavi sonrası %37,8’e düşer 1). Antibiyotik vermeden önce mutlaka örnek alın.
Hazırlık ve işlem basamakları
Section titled “Hazırlık ve işlem basamakları”- Anestezi: Damla şeklinde göz anestezisi kullanılır. Koruyucu içermeyen preparat tercih edilir (koruyucuların mikroorganizmalar üzerindeki etkisini önlemek için)
- Örnek alma aracı: Kimura spatülü veya golf bıçağı (konjonktiva ve kornea kazımak için). Ya da sentetik lifli bir sürüntü çubuğu
- Örnek alınacak yer: Lezyon ile normal doku arasındaki sınır bölge kazınır. İltihaplı alan ile normal kornea sınırında mikrop bulunduğu için bu sınır bölge en uygunudur
- Kurumanın önlenmesi: Sürüntü çubuğu ile örnek alınırken, çubuğu önceden steril serum fizyolojik ile ıslatın. Kuruma örnek kalitesini düşürür
- Sürüntü çubuğunun materyali: Sentetik lifli olanlar kullanılmalıdır. Doğal materyaller mikroorganizma çoğalmasını ve test yöntemini etkileyebilir
Dikkat edilmesi gerekenler
Section titled “Dikkat edilmesi gerekenler”- Bazı olgularda lezyon son derece kırılgan olabilir. Zorlayarak kazımayın
- Sürüntü ile lezyon kazımasında kültür pozitiflik oranının yaklaşık %50, 23G iğne ile %35 olduğu bildirilmiştir 1)
- Örnek miktarı azsa, test önceliğini laboratuvara açıkça belirtin
En önemli nokta, antibiyotik verilmeden önce örnek alınmasıdır. Antibiyotik verildikten sonra kültür pozitiflik oranı 77,3%’ten 37,8%’e belirgin şekilde düşer. Örnek alınacak yer, lezyon ile normal doku arasındaki sınır bölgesi olmalı; inflamasyonun merkezini değil, kenarını kazıyın. Kurumayı önlemek için sürüntü çubuğunu önceden steril serum fizyolojik ile ıslatın. Örnek alma aracı olarak sentetik lifli sürüntü çubuğu veya Kimura spatülü ya da golf knife kullanın ve işlemi topikal anestezi altında yapın. Lezyon kırılgansa zorla kazımayın.
3. Yayma ve mikroskobik inceleme (boyama yöntemleri ve değerlendirme)
Section titled “3. Yayma ve mikroskobik inceleme (boyama yöntemleri ve değerlendirme)”
Alınan örnek lam üzerine yayılır, boyanır ve ışık mikroskobunda incelenir. Yayma mikroskobik incelemenin pozitiflik oranının 58,1–73,7% olduğu bildirilmektedir1).
Örnek hazırlama basamakları
Section titled “Örnek hazırlama basamakları”- Lamı alkolle silin ve örnek yayılacak alanı arka yüzünden elmas kalem veya marker ile işaretleyin
- Malzemeyi ince bir tabaka halinde, nazikçe yayarak sürün. Sürüntü çubuğunda ise örnek azsa damga basar gibi hafifçe bastırarak, yeterli miktarda varsa yuvarlayarak sürün
- Metil alkol veya alev ile tespit edin
Boyama yönteminin seçimi
Section titled “Boyama yönteminin seçimi”Amaca göre beş boyama yönteminden biri seçilir.
- Giemsa boyası (Diff-Quik™): enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan nedenler dahil taramada kullanılan çok amaçlı bir boyama yöntemidir. Hızlı boyama kiti (Diff-Quik™) ile yaklaşık 15 saniyede geleneksel yöntemle eşdeğer boyama elde edilebilir. Tüm mikroorganizmalar maviye boyanır, ancak Gram-pozitif ve Gram-negatif ayrımı yapılamaz1)
- Gram boyası: bakteriyel enfeksiyonlara özel bir boyama yöntemidir. Gram-pozitif ve Gram-negatif ayrımını yapabilir ve bakterilerin şeklini (kok veya basil) gösterebilir. Faver G (Nissui Pharmaceutical) kullanılırsa yaklaşık 3 dakikada tamamlanır1)
- FungiFloraY® boyası: stilben sülfonik asit tipi bir floresan boyadır. β-bağlı polisakkaritleri (kitin ve selüloz) seçici olarak boyar ve mantarları (hif ve maya) ile Acanthamoeba kistlerini duyarlı şekilde saptar. Floresan mikroskopla incelenmesi gerekir1)
- İmmünofloresan: HSV (herpes simpleks virüsü) ve VZV (varisella-zoster virüsü) gibi viral antijenleri doğrudan gösterir1)
- Hansel boyası: alerjik konjonktiva hastalıklarında eozinofilleri saptamak için kullanılan özel bir boyadır
Mikroskop büyütmesi
Section titled “Mikroskop büyütmesi”- 400 kat: inflamatuvar hücrelerin türünü belirlemek için kullanılır (nötrofillerin çapı yaklaşık 12-15 μm’dir). Bakteriyel enfeksiyonda nötrofiller, viral enfeksiyonda lenfositler baskındır
- 1000x yağ immersiyonu: mikroorganizmaları gözlemek için kullanılır (bakterilerin çapı yaklaşık 1.0 μm’dir)
Etkene göre boyama yöntemleri ve karakteristik bulgular
Section titled “Etkene göre boyama yöntemleri ve karakteristik bulgular”| Şüphelenilen patojen | Önerilen boyama | Karakteristik bulgular |
|---|---|---|
| Bakteriler (genel) | Gram boyama | Gram-pozitif/Gram-negatif koklar ve basiller |
| Gonokok | Diff-Quik™ | Kahve çekirdeği biçimli diplokoklar; nötrofiller içinde |
| Mantarlar | Fungiflora Y® | Hifler ve konidyalar (floresan) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Çift duvarlı kistler (yaklaşık 10×10 μm) |
| Virüsler (HSV gibi) | Floresan antikor yöntemi | Enfekte hücrelerde özgül floresans |
| Eozinofiller (alerji) | Hansel boyaması | Tek bir eozinofil olsa bile pozitif |
4. Kültür incelemesi
Section titled “4. Kültür incelemesi”Kültür incelemesinde, etken mikroorganizma kültür ortamında çoğaltılır ve böylece tanımlanması ile ilaç duyarlılık testi yapılabilir. Kültür pozitifliği oranı, merkeze ve koşullara göre %37,6–74,3 arasında değişir 1). Dış göz yüzeyinde normal flora bulunduğundan, izole edilen mikroorganizma her zaman etken olmayabilir. Mikroskopi bulguları, göz bulguları, ilaç duyarlılığı ve tedavi yanıtı birlikte değerlendirilir.
Başlıca kültür ortamı türleri
Section titled “Başlıca kültür ortamı türleri”| Kültür ortamı | Hedef mikroorganizma | Kültür koşulları |
|---|---|---|
| kanlı agar besiyeri | yaygın bakteriler (hemoliz değerlendirilebilir) | 37°C, aerobik |
| çikolata agar besiyeri | Haemophilus türleri ve gonokoklar (V ve X faktörlerini içerir) | 37°C, CO2 |
| Sabouraud/patates dekstroz besiyeri | mantarlar | 37°C ve oda sıcaklığı olmak üzere iki koşulda kültür edilir |
| %1,5 NN agar plak | Acanthamoeba | 30°C |
| Taşıma besiyeri (Seed Swab®, Transwab® vb.) | Yaygın bakteriler (kurumda katı besiyeri yoksa) | Oda sıcaklığında taşıma (pozitiflik oranı %50–69)1) |
Örneğin saklanması
Section titled “Örneğin saklanması”Örneğin laboratuvara gönderilmesi zaman alacaksa nasıl saklanacağı, etken mikroorganizmanın türüne göre değişir.
- Yaygın bakteriler: 4°C’de (buzdolabında) saklayın
- Gonokok ve menengokok: Soğuğa duyarlı oldukları ve kolayca öldükleri için oda sıcaklığında saklayın
- Zorunlu anaerob bakterilerden şüpheleniliyorsa: Anaerobik taşıma kabında saklayın
Test isteme sırasında önemli noktalar
Section titled “Test isteme sırasında önemli noktalar”- İstek formuna klinik bulguları ve hedef mikroorganizmayı açıkça yazın. Seçici besiyeri eklenmesi saptama oranını artırır
- Örnek miktarı azsa, test önceliğini belirtin (örneğin: kültür > mikroskopi, bakteri > mantar)
İlaç duyarlılık testinin yorumu
Section titled “İlaç duyarlılık testinin yorumu”Duyarlılık testlerinde, genellikle S (duyarlı) olarak değerlendirilenler arasından MIC’si (minimum inhibitör konsantrasyon) daha düşük olan ilaç seçilir. Ancak R (dirençli) olarak değerlendirilse bile klinik olarak etkili olabilir; bu nedenle bütüncül değerlendirme gerekir. Mantar ve Acanthamoeba duyarlılık testleri için yorum kriterlerinin henüz belirlenmediğini unutmayın 1).
Kültür pozitiflik oranı %37.6–74.3 arasındadır ve negatif sonuç enfeksiyonu dışlamaz. En çok etkileyen faktör örnek alma zamanıdır; antimikrobiyal tedaviden sonra alınırsa pozitiflik oranı yaklaşık yarıya iner. Ayrıca, yayma negatif olgularda kültür pozitifliği %42.7–47.1, yayma pozitif olgularda ise %57.1–82.4’tür; bu nedenle iki testin birlikte kullanılması tanı doğruluğunu artırır. Acanthamoeba’nın genel merkezlerde izole edilmesi ve kültüre edilmesi zor olduğundan, kistin çift duvarlı yapısını doğrulamak için Diff-Quik™ boyalı mikroskobik inceleme öncelikli olmalıdır.
5. Eozinofil incelemesi (alerjik konjonktival hastalığın kesin tanısı)
Section titled “5. Eozinofil incelemesi (alerjik konjonktival hastalığın kesin tanısı)”
Alerjik konjonktival hastalığın kesin tanısı için, Hansel ile boyanmış konjonktival kazıntı yaymasında eozinofil saptanmalıdır 2).
Örnek alma tekniği
Section titled “Örnek alma tekniği”- Topikal anesteziden sonra üst göz kapağını çevirin
- Göz kapağı konjonktivasını cam çubukla hafifçe masaj yapın ve konjonktiva yüzeyinde biriken mukusu pens veya spatula ile toplayın
- Lam üzerine yayıp Hansel boyaması yapın ve ışık mikroskobuyla inceleyin
Bir mikroskop altında tek bir eozinofil bile görülürse sonuç pozitif kabul edilir ve alerjik konjonktiva hastalığının kesin tanısı konur2). Örnek alma sırasında kanama olursa, kandaki eozinofiller örneğe karışabileceğinden diğer gözde tekrar inceleme yapılır.
Alerjik konjonktiva hastalığının tanı sistemi
Section titled “Alerjik konjonktiva hastalığının tanı sistemi”Alerjik konjonktiva hastalığı klinik uygulama kılavuzunun (3. baskı) temel aldığı tanının üç aşaması aşağıdaki gibidir2).
| Tanı kategorisi | Gerekli koşullar |
|---|---|
| Klinik tanı | Yalnızca klinik bulgular (alerjik semptomlar ve bulgular) |
| Klinik kesin tanı | Klinik bulgular + alerjik yatkınlığın doğrulanması (gözyaşında total IgE pozitif, deri testi, serum antijene özgü IgE pozitif) |
| Kesin tanı | Klinik bulgular + eozinofil testi pozitif (gözde lokal alerjik yanıtın doğrulanması) |
Klinik kesin tanı yalnızca sistemik alerjik yatkınlığı doğrular ve gözdeki lokal alerjik yanıtı doğrudan kanıtlamaz. Kesin tanı, yalnızca eozinofil testi gözdeki lokal alerjik yanıtı doğrudan doğruladığında konur2).
6. Test sonuçlarının yorumlanması ve genel değerlendirme
Section titled “6. Test sonuçlarının yorumlanması ve genel değerlendirme”İnflamatuvar hücre tipine göre etkenin tahmini
Section titled “İnflamatuvar hücre tipine göre etkenin tahmini”Mikrop bulunmasa bile, inflamatuvar hücrelerin tipi olası etkeni düşündürebilir.
- Nötrofil baskınlığı → bakteriyel enfeksiyonu düşündürür
- Lenfosit baskınlığı → viral enfeksiyonu düşündürür
- Eozinofil baskınlığı → alerjik veya paraziter enfeksiyonu düşündürür
Nedensel etkenin genel değerlendirmesi
Section titled “Nedensel etkenin genel değerlendirmesi”İzole edilen mikroorganizmanın nedensel etken olup olmadığı bütüncül olarak değerlendirilir.
- Mikroskopi bulguları ile kültürde izole edilen mikroorganizmanın uyumu (mikroskopta görülen mikroorganizmanın kültürde üreyenle aynı olup olmadığı)
- Göz bulgularıyla uyum (örneğin lezyon bölgesinden örnek alınıp alınmadığı)
- İlaç duyarlılık testi sonuçları ile gerçek tedavi etkisinin uyumu
Özel patojenlere dikkat
Section titled “Özel patojenlere dikkat”- gonokok: kuruma ve sıcaklık değişikliklerine karşı hassastır, kolayca ölür. Örnek alındıktan hemen sonra işlenmesi zorunludur. Buzdolabında saklama uygun değildir (oda sıcaklığında saklayın)
- Acanthamoeba: genel merkezlerde izolasyon ve kültür zordur. Dif-Quik™ boyamada çift duvarlı kistlerin doğrulanmasına öncelik verilmelidir
Sürüntü mikroskobisi ve kültür testinin birlikte kullanımı
Section titled “Sürüntü mikroskobisi ve kültür testinin birlikte kullanımı”Sürüntü mikroskobisi negatif olan olgularda bile kültür pozitifliği oranı %42,7–47,1’e ulaşabilir1). Öte yandan, sürüntü pozitif olgularda kültür pozitifliği oranı %57,1–82,4’tür ve her iki testin aynı anda yapılması duyarlılığı artırır. PCR testi, sürüntü mikroskobisi ve kültür testine yardımcı olarak yararlıdır; ancak bakteriyel keratitin yalnızca PCR ile tanımlanması önerilmez1).
7. En yeni araştırmalar ve geleceğe yönelik beklentiler
Section titled “7. En yeni araştırmalar ve geleceğe yönelik beklentiler”- Metagenomik analiz (yeni nesil dizileme): Kültürlenemeyen mikroorganizmalar da dahil olmak üzere göz yüzeyi mikrobiyomunu kapsamlı biçimde analiz etmek giderek mümkün olmaktadır. Geleneksel kültür testleriyle tanımlanamayan patojenlerin saptanması beklenmektedir
- Multiplex PCR: Birden fazla patojeni (bakteri, mantar, virüs ve Acanthamoeba) tek bir testte aynı anda hızlı biçimde saptayabilen sistemlerin geliştirilmesi ilerlemektedir. Enfeksiyöz keratitin tanısal doğruluğu ve hızının artması beklenmektedir3)
- MALDI-TOF kütle spektrometrisi: Kültürden üretilen bakterileri yalnızca birkaç dakika içinde tanımlayabilen bir kütle spektrometrisi tekniği. Geleneksel biyokimyasal tanımlama yöntemlerine göre süreyi büyük ölçüde kısaltabilir ve göz enfeksiyonlarında kullanımı araştırılmaktadır4)
- Eozinofil testinin duyarlılık ve özgüllüğünün iyileştirilmesi: Elektron mikroskobu ve floresan işaretli antikorlar kullanılarak eozinofillerin yüksek duyarlılıkla saptanmasına yönelik yöntemlerin geliştirilmesi ilerlemektedir. Geleneksel Hansel boyamasının saptama duyarlılığında sınırlamaları vardır ve daha duyarlı bir yöntem oluşturulursa tanısal doğruluk artabilir
8. Kaynaklar
Section titled “8. Kaynaklar”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.