Citología y cultivo conjuntival (pruebas de infección y alergia)
1. Qué son la citología y el cultivo de raspado conjuntival
Sección titulada «1. Qué son la citología y el cultivo de raspado conjuntival»La citología y el cultivo microbiano del raspado conjuntival son pruebas utilizadas para identificar el microorganismo causante en las enfermedades oculares infecciosas, realizar pruebas de sensibilidad a los fármacos y confirmar eosinófilos en la enfermedad conjuntival alérgica (diagnóstico definitivo). Al identificar pronto el microorganismo causante y elegir un antibiótico eficaz, se puede esperar una mejoría de los signos de infección.
La Guía para el Diagnóstico y Tratamiento de la Queratitis Infecciosa (3.ª edición) recomienda firmemente realizar microscopia de frotis y cultivo cuando se sospecha queratitis infecciosa (nivel de evidencia: C)1). Se consideran pruebas esenciales, especialmente en casos de queratitis urgente u endoftalmitis, o cuando se sospecha la presencia de un microorganismo causante poco habitual.
En la Guía para el Diagnóstico y Tratamiento de la Enfermedad Conjuntival Alérgica (3.ª edición), la prueba de eosinófilos (tinción de Hansel) se indica claramente como base para el diagnóstico definitivo, y es una prueba indispensable para pasar de un diagnóstico clínico a un diagnóstico definitivo2).
Indicaciones
Sección titulada «Indicaciones»Cuando se sospecha una enfermedad infecciosa
Sección titulada «Cuando se sospecha una enfermedad infecciosa»- Queratitis y conjuntivitis bacterianas (especialmente urgentes)
- Conjuntivitis gonocócica (el diagnóstico precoz es importante porque puede causar perforación corneal)
- Queratitis por Acanthamoeba (el cultivo es difícil en centros generales, por lo que se recomienda el examen microscópico)
- Queratitis fúngica
- Casos en los que se sospecha un agente causal especial (como queratitis refractaria o resistente al tratamiento)
Diagnóstico definitivo de las enfermedades oculares alérgicas
Sección titulada «Diagnóstico definitivo de las enfermedades oculares alérgicas»- Conjuntivitis alérgica (diagnóstico definitivo mediante análisis de eosinófilos)
- Queratoconjuntivitis vernal (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Queratoconjuntivitis atópica (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Se realiza principalmente con dos objetivos. Primero, cuando se sospecha queratitis infecciosa o conjuntivitis; es una prueba indispensable, especialmente en infecciones urgentes como queratitis y endoftalmitis, o cuando se sospechan microorganismos causales especiales como gonococo, Acanthamoeba u hongos. Segundo, se usa para confirmar la enfermedad conjuntival alérgica; si se identifica хотя sea un eosinófilo con la tinción de Hansel, el diagnóstico queda confirmado. Los hallazgos clínicos por sí solos solo permiten un diagnóstico clínico, por lo que se realiza la prueba de eosinófilos cuando se necesita un diagnóstico definitivo.
2. Técnica de toma de muestras
Sección titulada «2. Técnica de toma de muestras»El principio es tomar la muestra con firmeza desde la zona donde se sospecha que está presente el microorganismo causal. El momento de la toma influye mucho en la tasa de positividad. La tasa de positividad del cultivo antes de los antibióticos es del 77,3%, mientras que después del tratamiento se reduce al 37,8% 1). Asegúrese de tomar la muestra antes de administrar antibióticos.
Preparación y procedimiento
Sección titulada «Preparación y procedimiento»- Anestesia: Utilice anestesia en gotas oftálmicas. Se prefiere una preparación sin conservantes (para evitar el efecto de los conservantes sobre los microorganismos)
- Instrumento de toma: espátula de Kimura o cuchillete de golf (para raspado de la conjuntiva y la córnea). O bien un hisopo de fibra sintética
- Lugar de toma: Raspe la zona límite entre la lesión y el tejido normal. Como hay microorganismos en el borde entre la zona inflamada y la córnea normal, esa zona de límite es la más adecuada
- Prevención del secado: cuando se usa un hisopo, humedézcalo previamente con solución salina estéril. El secado reduce la calidad de la muestra
- Material del hisopo: utilice materiales de fibra sintética. Los materiales naturales pueden afectar el crecimiento microbiano y el método de prueba
Precauciones
Sección titulada «Precauciones»- En algunos casos, la lesión es extremadamente frágil. No raspar con fuerza
- Se ha informado que la tasa de positividad del cultivo al raspar la lesión con un hisopo es de aproximadamente 50%, y con una aguja 23G es de 35% 1)
- Si la cantidad de muestra es pequeña, indique claramente al laboratorio la prioridad de las pruebas
Lo más importante es recogerla antes de administrar antibióticos. Después de los antibióticos, la tasa de positividad del cultivo disminuye de forma notable, del 77.3% al 37.8%. El sitio de toma debe ser la zona de transición entre la lesión y el tejido normal; raspe el borde y no el centro de la inflamación. Humedezca previamente el hisopo con solución salina estéril para evitar que se seque. Use un hisopo de fibra sintética o una espátula de Kimura o cuchillo de golf, y realice el procedimiento bajo anestesia tópica. Si la lesión es frágil, no raspe con fuerza.
3. Frotis y examen microscópico (métodos de tinción e interpretación)
Sección titulada «3. Frotis y examen microscópico (métodos de tinción e interpretación)»
La muestra recogida se extiende sobre un portaobjetos, se tiñe y se observa al microscopio óptico. La tasa de positividad del examen microscópico del frotis se informa en 58.1–73.7%1).
Procedimiento de preparación de la muestra
Sección titulada «Procedimiento de preparación de la muestra»- Limpie el portaobjetos con alcohol y marque por la parte posterior la zona de extensión de la muestra con un lápiz de diamante o un rotulador
- Extienda el material en una capa fina, distribuyéndolo suavemente. En el caso de un hisopo, extiéndalo presionando ligeramente como si sellara cuando la muestra es pequeña, o rodándolo cuando hay una cantidad suficiente
- Fije con alcohol metílico o por llama
Selección del método de tinción
Sección titulada «Selección del método de tinción»Elija entre cinco métodos de tinción según el propósito.
- Tinción de Giemsa (Diff-Quik™): método de tinción multipropósito usado para el cribado, incluidas causas infecciosas y no infecciosas. Con el kit de tinción rápida (Diff-Quik™), se obtiene una tinción equivalente al método convencional en unos 15 segundos. Todos los microorganismos se tiñen de azul, pero no se puede distinguir entre los grampositivos y los gramnegativos1)
- Tinción de Gram: método de tinción especializado en infecciones bacterianas. Permite distinguir entre Gram positivas y Gram negativas y confirmar la morfología bacteriana (cocos o bacilos). Si se usa Faver G (Nissui Pharmaceutical), se completa en unos 3 minutos1)
- Tinción FungiFloraY®: un colorante fluorescente de tipo ácido estibénico sulfonado. Tiñe de forma selectiva los polisacáridos con enlaces β (quitina y celulosa) y detecta con alta sensibilidad hongos (hifas y levaduras) y quistes de Acanthamoeba. Se requiere observación con microscopio de fluorescencia1)
- Inmunofluorescencia: demuestra directamente antígenos virales como HSV (virus del herpes simple) y VZV (virus varicela-zóster)1)
- Tinción de Hansel: tinción específica utilizada para detectar eosinófilos en las enfermedades alérgicas conjuntivales
Aumento para la microscopía
Sección titulada «Aumento para la microscopía»- 400x: se usa para identificar el tipo de células inflamatorias (los neutrófilos tienen un diámetro de unos 12-15 μm). En las infecciones bacterianas predominan los neutrófilos; en las infecciones virales predominan los linfocitos
- 1000x con inmersión en aceite: se usa para observar los microorganismos (las bacterias tienen un diámetro de unos 1.0 μm)
Métodos de tinción y hallazgos característicos según el patógeno
Sección titulada «Métodos de tinción y hallazgos característicos según el patógeno»| Patógeno sospechoso | Tinción recomendada | Hallazgos característicos |
|---|---|---|
| Bacterias (general) | Tinción de Gram | Cocos y bacilos grampositivos/gramnegativos |
| Gonococo | Diff-Quik™ | Diplococos con forma de grano de café; dentro de neutrófilos |
| Hongos | Fungiflora Y® | Hifas y conidios (fluorescencia) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Quistes de doble pared (unos 10×10 μm) |
| Virus (como el VHS) | Inmunofluorescencia | Fluorescencia específica en células infectadas |
| Eosinófilos (alergia) | Tinción de Hansel | Positivo incluso con un solo eosinófilo |
4. Cultivo
Sección titulada «4. Cultivo»En el cultivo, el microorganismo causante se hace crecer en un medio de cultivo, lo que permite su identificación y la prueba de sensibilidad a los fármacos. La tasa de cultivo positivo varía según la institución y las condiciones, entre 37.6 y 74.3% 1). Como en la superficie ocular externa hay flora normal, la bacteria aislada no siempre es la causante. La valoración debe hacerse de forma integral según el examen microscópico, los hallazgos oculares, la sensibilidad a los fármacos y la respuesta al tratamiento.
Principales tipos de medios de cultivo
Sección titulada «Principales tipos de medios de cultivo»| Medio de cultivo | Microorganismo objetivo | Condiciones de cultivo |
|---|---|---|
| medio de agar sangre | bacterias comunes (permite evaluar la hemólisis) | 37 °C, aerobio |
| medio de agar chocolate | Haemophilus y gonococos (contiene factores V y X) | 37 °C, CO2 |
| medio Sabouraud/de dextrosa de papa | hongos | cultivo en dos condiciones: 37 °C y temperatura ambiente |
| placa de agar NN al 1.5% | Acanthamoeba | 30 °C |
| Medio de transporte (Seed Swab®, Transwab®, etc.) | Bacterias comunes (cuando el centro no dispone de medio sólido) | Transporte a temperatura ambiente (tasa de positividad 50–69%)1) |
Conservación de la muestra
Sección titulada «Conservación de la muestra»La forma de conservar la muestra cuando tardará en llegar al laboratorio depende del tipo de microorganismo causante.
- Bacterias comunes: Conservar a 4°C (refrigerador)
- Gonococos y meningococos: Conservar a temperatura ambiente porque son sensibles al frío y mueren con facilidad
- Si se sospechan bacterias anaerobias estrictas: Conservar en un medio de transporte anaerobio
Puntos clave al solicitar la prueba
Sección titulada «Puntos clave al solicitar la prueba»- Indique claramente en la hoja de solicitud los hallazgos clínicos y el microorganismo objetivo. Agregar medios selectivos mejora la tasa de detección
- Si la cantidad de muestra es pequeña, añada la prioridad de las pruebas (por ejemplo, cultivo > microscopía, bacterias > hongos)
Interpretación de la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos
Sección titulada «Interpretación de la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos»En las pruebas de sensibilidad, suele elegirse el fármaco con menor MIC entre los clasificados como S (sensible). Sin embargo, aunque se clasifique como R (resistente), puede ser clínicamente eficaz, por lo que se necesita una evaluación integral. Tenga en cuenta que en las pruebas de sensibilidad para hongos y Acanthamoeba no se han establecido criterios de interpretación 1).
La tasa de positividad del cultivo es de 37.6–74.3%, y un resultado negativo no descarta la infección. El factor que más influye es el momento de la toma de la muestra; cuando se toma después de administrar antimicrobianos, la positividad se reduce aproximadamente a la mitad. Además, la tasa de positividad del cultivo en casos con frotis negativo es de 42.7–47.1%, y en casos con frotis positivo de 57.1–82.4%, por lo que combinar ambas pruebas mejora la precisión diagnóstica. Como Acanthamoeba es difícil de aislar y cultivar en centros generales, se debe dar prioridad al examen microscópico con tinción Diff-Quik™ para confirmar la estructura de doble pared del quiste.
5. Examen de eosinófilos (diagnóstico definitivo de la enfermedad conjuntival alérgica)
Sección titulada «5. Examen de eosinófilos (diagnóstico definitivo de la enfermedad conjuntival alérgica)»
Para un diagnóstico definitivo de la enfermedad conjuntival alérgica, deben detectarse eosinófilos en un frotis de raspado conjuntival teñido con Hansel 2).
Técnica de toma
Sección titulada «Técnica de toma»- Después de la anestesia tópica, evertir el párpado superior
- Masajear suavemente la conjuntiva palpebral con una varilla de vidrio y recoger con pinzas o una espátula el moco acumulado en la superficie conjuntival
- Extender en un portaobjetos, realizar la tinción de Hansel y observar al microscopio óptico
Interpretación
Sección titulada «Interpretación»Si se confirma incluso un eosinófilo al microscopio, se considera positivo y se establece el diagnóstico definitivo de la enfermedad conjuntival alérgica2). Si se observa sangrado al tomar la muestra, los eosinófilos de la sangre pueden mezclarse, por lo que debe repetirse la prueba en el otro ojo.
Sistema diagnóstico de la enfermedad conjuntival alérgica
Sección titulada «Sistema diagnóstico de la enfermedad conjuntival alérgica»Las tres etapas diagnósticas basadas en la Guía de práctica clínica de la enfermedad conjuntival alérgica (tercera edición) son las siguientes2).
| Categoría diagnóstica | Criterios necesarios |
|---|---|
| Diagnóstico clínico | Solo hallazgos clínicos (síntomas y signos alérgicos) |
| Diagnóstico clínico definitivo | Hallazgos clínicos + confirmación de predisposición alérgica (IgE total en lágrimas positiva, prueba cutánea, IgE sérica específica frente al antígeno positiva) |
| Diagnóstico definitivo | Hallazgos clínicos + prueba de eosinófilos positiva (confirmación de una reacción alérgica local ocular) |
El diagnóstico clínico definitivo solo confirma una predisposición alérgica sistémica y no demuestra directamente una reacción alérgica en el ojo. Solo cuando la prueba de eosinófilos demuestra directamente una reacción alérgica local ocular se considera diagnóstico definitivo2).
6. Interpretación de los resultados de las pruebas y valoración global
Sección titulada «6. Interpretación de los resultados de las pruebas y valoración global»Estimación del patógeno según el tipo de células inflamatorias
Sección titulada «Estimación del patógeno según el tipo de células inflamatorias»Aunque no se encuentren microorganismos, el tipo de células inflamatorias puede servir como pista para estimar el patógeno.
- Predominio de neutrófilos → sugiere infección bacteriana
- Predominio de linfocitos → sugiere infección viral
- Predominio de eosinófilos → sugiere infección alérgica o parasitaria
Valoración global del microorganismo causante
Sección titulada «Valoración global del microorganismo causante»Si el microorganismo aislado es o no el causante se determina de forma integral.
- Correspondencia entre los hallazgos microscópicos y el microorganismo aislado en el cultivo (si el microorganismo visto al microscopio coincide con el que creció en el cultivo)
- Correspondencia con los hallazgos oculares (si la muestra se tomó de la zona de la lesión)
- Correspondencia entre los resultados de la prueba de sensibilidad a los fármacos y el efecto real del tratamiento
Precaución con patógenos especiales
Sección titulada «Precaución con patógenos especiales»- gonococo: es vulnerable a la desecación y a los cambios de temperatura, y muere con facilidad. Es indispensable procesarlo de inmediato después de la toma. El almacenamiento en refrigeración no es adecuado (conservar a temperatura ambiente)
- Acanthamoeba: el aislamiento y el cultivo son difíciles en instalaciones generales. Con la tinción Dif-Quik™ se debe dar prioridad a confirmar quistes con pared doble
Combinación de microscopía de frotis y cultivo
Sección titulada «Combinación de microscopía de frotis y cultivo»Incluso en los casos con microscopía de frotis negativa, la tasa de positividad del cultivo puede alcanzar 42.7–47.1%1). Por otro lado, en los casos con frotis positivo, la tasa de positividad del cultivo es de 57.1–82.4%, y realizar ambas pruebas al mismo tiempo aumenta la sensibilidad. La PCR es útil como apoyo a la microscopía de frotis y al cultivo, pero no se recomienda diagnosticar queratitis bacteriana solo con PCR1).
7. Investigación más reciente y perspectivas futuras
Sección titulada «7. Investigación más reciente y perspectivas futuras»- Análisis metagenómico (secuenciación de nueva generación): cada vez es más posible analizar de forma integral el microbioma de la superficie ocular, incluidos los microorganismos que no pueden cultivarse. Se espera detectar patógenos que no pueden identificarse con las pruebas de cultivo tradicionales
- PCR múltiple: avanza el desarrollo de sistemas que pueden detectar de forma rápida y simultánea varios patógenos (bacterias, hongos, virus y Acanthamoeba) en una sola prueba. Se espera mejorar la precisión y la rapidez del diagnóstico de la queratitis infecciosa3)
- Espectrometría de masas MALDI-TOF: técnica de espectrometría de masas que puede identificar bacterias cultivadas en solo unos minutos. Puede reducir de forma considerable el tiempo en comparación con los métodos bioquímicos convencionales, y se está estudiando su aplicación en las infecciones oftálmicas4)
- Afinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba de eosinófilos: avanza el desarrollo de métodos de detección de eosinófilos de alta sensibilidad mediante microscopía electrónica y anticuerpos marcados con fluorescencia. La tinción de Hansel convencional tiene limitaciones en la sensibilidad de detección, y si se establece un método más sensible, la precisión diagnóstica podría mejorar
8. Referencias
Sección titulada «8. Referencias»- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.