Citologia e coltura congiuntivale (test per infezione e allergia)
1. Che cosa sono la citologia e la coltura del raschiato congiuntivale
Sezione intitolata “1. Che cosa sono la citologia e la coltura del raschiato congiuntivale”La citologia del raschiato congiuntivale e la coltura microbica sono esami usati per identificare il microrganismo causale nelle malattie oculari infettive, eseguire il test di sensibilità ai farmaci e confermare gli eosinofili nella malattia congiuntivale allergica (diagnosi definitiva). Identificando precocemente il microrganismo causale e scegliendo un antibiotico efficace, ci si può aspettare un miglioramento dei segni di infezione.
Le Linee guida per la diagnosi e il trattamento della cheratite infettiva (3ª edizione) raccomandano fortemente di eseguire microscopia dello striscio e coltura quando si sospetta una cheratite infettiva (livello di evidenza: C)1). Sono considerate indagini essenziali, soprattutto nei casi di cheratite urgente o endoftalmite, oppure quando si sospetta la presenza di un microrganismo causale insolito.
Nelle Linee guida per la diagnosi e il trattamento della malattia congiuntivale allergica (3ª edizione), l’esame degli eosinofili (colorazione di Hansel) è indicato chiaramente come base per la diagnosi definitiva ed è un esame indispensabile per passare da una diagnosi clinica a una diagnosi definitiva2).
Indicazioni
Sezione intitolata “Indicazioni”Quando si sospetta una malattia infettiva
Sezione intitolata “Quando si sospetta una malattia infettiva”- Cheratite e congiuntivite batteriche (soprattutto urgenti)
- Congiuntivite gonococcica (la diagnosi precoce è importante perché può causare perforazione corneale)
- Cheratite da Acanthamoeba (la coltura è difficile nelle strutture generali, quindi si raccomanda l’esame microscopico)
- Cheratite fungina
- Casi in cui si sospetta un agente causale particolare (come cheratite refrattaria o resistente al trattamento)
Diagnosi definitiva delle malattie oculari allergiche
Sezione intitolata “Diagnosi definitiva delle malattie oculari allergiche”- Congiuntivite allergica (diagnosi definitiva mediante esame degli eosinofili)
- Cheratocongiuntivite vernale (vernal keratoconjunctivitis: VKC)
- Cheratocongiuntivite atopica (atopic keratoconjunctivitis: AKC)
Si esegue principalmente per due scopi. Primo, quando si sospettano cheratite infettiva o congiuntivite; è un esame indispensabile, soprattutto nelle infezioni urgenti come cheratite ed endoftalmite, o quando si sospettano agenti causali particolari come gonococco, Acanthamoeba o funghi. Secondo, serve a confermare la malattia congiuntivale allergica; se con la colorazione di Hansel si identifica anche un solo eosinofilo, la diagnosi è confermata. I soli reperti clinici consentono solo una diagnosi clinica, quindi l’esame degli eosinofili si esegue quando è necessaria una diagnosi definitiva.
2. Tecnica di prelievo del campione
Sezione intitolata “2. Tecnica di prelievo del campione”Il principio è prelevare con decisione il campione dall’area in cui si sospetta la presenza del germe causale. Il momento del prelievo influisce molto sulla positività. La positività della coltura prima degli antibiotici è del 77,3%, mentre dopo il trattamento scende al 37,8% 1). Il campione va quindi prelevato prima di somministrare antibiotici.
Preparazione e procedura
Sezione intitolata “Preparazione e procedura”- Anestesia: utilizzare anestesia in gocce oculari. È preferibile una formulazione senza conservanti (per evitare l’effetto dei conservanti sui microrganismi)
- Strumento di prelievo: spatola di Kimura o coltello da golf (per il raschiamento di congiuntiva e cornea). Oppure un tampone in fibra sintetica
- Sede del prelievo: raschiare il margine tra la lesione e il tessuto normale. Poiché i germi si trovano al confine tra la zona infiammata e la cornea normale, quella zona di margine è la più adatta
- Prevenzione dell’essiccamento: quando si usa un tampone, inumidirlo prima con soluzione fisiologica sterile. L’essiccamento riduce la qualità del campione
- Materiale del tampone: usare materiali in fibra sintetica. I materiali naturali possono influire sulla crescita dei microrganismi e sul metodo di esame
Precauzioni
Sezione intitolata “Precauzioni”- In alcuni casi la lesione è estremamente fragile. Non raschiare con forza
- È stato riportato che la positività della coltura nel raschiamento della lesione con tampone è di circa il 50%, mentre con ago 23G è del 35% 1)
- Se la quantità di campione è scarsa, indicare chiaramente al laboratorio la priorità degli esami
La cosa più importante è prelevare il campione prima della somministrazione degli antibiotici. Dopo gli antibiotici, il tasso di positività della coltura scende nettamente dal 77,3% al 37,8%. Il sito di prelievo deve essere la zona di confine tra la lesione e il tessuto normale; si deve raschiare il margine e non il centro dell’infiammazione. Inumidire in anticipo il tampone con soluzione salina sterile per evitare l’essiccamento. Usare un tampone in fibra sintetica oppure una spatola di Kimura o un golf knife, ed eseguire la procedura in anestesia topica. Se la lesione è fragile, non raschiare con forza.
3. Striscio ed esame microscopico (metodi di colorazione e interpretazione)
Sezione intitolata “3. Striscio ed esame microscopico (metodi di colorazione e interpretazione)”
Il campione raccolto viene strisciato su un vetrino, colorato e osservato al microscopio ottico. Il tasso di positività dell’esame microscopico dello striscio è riportato come 58,1–73,7%1).
Procedura di preparazione del campione
Sezione intitolata “Procedura di preparazione del campione”- Pulire il vetrino con alcol e segnare sul retro l’area di striscio del campione con una matita diamantata o un pennarello
- Stendere il materiale in uno strato sottile, distribuendolo delicatamente. Nel caso del tampone, se la quantità di campione è scarsa, stenderlo premendo leggermente come se si timbrasse; se è sufficiente, stenderlo facendolo rotolare
- Fissare con alcol metilico o alla fiamma
Scelta del metodo di colorazione
Sezione intitolata “Scelta del metodo di colorazione”Scegliere tra cinque metodi di colorazione in base all’obiettivo.
- Colorazione di Giemsa (Diff-Quik™): metodo di colorazione multiuso usato per lo screening, anche delle cause infettive e non infettive. Con il kit di colorazione rapida (Diff-Quik™), in circa 15 secondi si ottiene una colorazione equivalente al metodo convenzionale. Tutti i microrganismi si colorano di blu, ma non è possibile distinguere tra Gram-positivi e Gram-negativi1)
- Colorazione di Gram: metodo di colorazione specializzato per le infezioni batteriche. Consente di distinguere i batteri Gram-positivi da quelli Gram-negativi e di verificare la morfologia batterica (cocchi o bacilli). Con Faver G (Nissui Pharmaceutical), si completa in circa 3 minuti1)
- Colorazione FungiFloraY®: colorante fluorescente di tipo acido stilbene solfonico. Colora in modo selettivo i polisaccaridi con legami β (chitina e cellulosa) e rileva con sensibilità funghi (ife e lieviti) e cisti di Acanthamoeba. È necessaria l’osservazione al microscopio a fluorescenza1)
- Immunofluorescenza: dimostra direttamente antigeni virali come HSV (virus herpes simplex) e VZV (virus varicella-zoster)1)
- Colorazione di Hansel: colorazione speciale usata per rilevare gli eosinofili nelle malattie congiuntivali allergiche
Ingrandimento al microscopio
Sezione intitolata “Ingrandimento al microscopio”- 400x: usato per identificare il tipo di cellule infiammatorie (i neutrofili hanno un diametro di circa 12–15 μm). Nelle infezioni batteriche predominano i neutrofili; nelle infezioni virali predominano i linfociti
- 1000x a immersione in olio: usato per osservare i microrganismi (i batteri hanno un diametro di circa 1,0 μm)
Metodi di colorazione e reperti caratteristici in base al patogeno
Sezione intitolata “Metodi di colorazione e reperti caratteristici in base al patogeno”| Patogeno sospetto | Colorazione raccomandata | Reperti caratteristici |
|---|---|---|
| Batteri (generale) | Colorazione di Gram | Cocchi e bacilli Gram-positivi/Gram-negativi |
| Gonococco | Diff-Quik™ | Diplococchi a forma di chicco di caffè; fagocitati nei neutrofili |
| Funghi | Fungiflora Y® | Ife e conidi (fluorescenza) |
| Acanthamoeba | Fungiflora Y® | Cisti a doppia parete (circa 10×10 μm) |
| Virus (come HSV) | Metodo con anticorpi fluorescenti | Fluorescenza specifica nelle cellule infette |
| Eosinofili (allergia) | Colorazione di Hansel | Positivo anche con un solo eosinofilo |
4. Esame colturale
Sezione intitolata “4. Esame colturale”Nell’esame colturale, il microrganismo causa viene fatto crescere su un terreno di coltura, consentendone l’identificazione e il test di sensibilità ai farmaci. La percentuale di colture positive varia in base alla struttura e alle condizioni, dal 37,6 al 74,3% 1). Poiché sulla superficie oculare esterna è presente flora normale, il microrganismo isolato non è necessariamente il responsabile. La valutazione va fatta complessivamente in base ai risultati dell’esame microscopico, ai reperti oculari, alla sensibilità ai farmaci e alla risposta al trattamento.
Principali tipi di terreni di coltura
Sezione intitolata “Principali tipi di terreni di coltura”| Terreno di coltura | Microrganismo bersaglio | Condizioni di coltura |
|---|---|---|
| terreno agar sangue | batteri comuni (consente di valutare l’emolisi) | 37°C, aerobio |
| terreno agar cioccolato | Haemophilus e gonococchi (contiene fattori V e X) | 37°C, CO2 |
| terreno Sabouraud/di destrosio di patata | funghi | coltivato in due condizioni: 37°C e temperatura ambiente |
| piastra di agar NN all’1,5% | Acanthamoeba | 30°C |
| Terreno di trasporto (Seed Swab®, Transwab® ecc.) | Batteri comuni (quando la struttura non dispone di terreno solido) | Trasporto a temperatura ambiente (tasso di positività 50–69%)1) |
Conservazione del campione
Sezione intitolata “Conservazione del campione”Il modo di conservare il campione quando occorre tempo per inviarlo al laboratorio dipende dal tipo di microrganismo causale.
- Batteri comuni: conservare a 4°C (frigorifero)
- Gonococchi e meningococchi: conservare a temperatura ambiente perché sono sensibili al freddo e muoiono facilmente
- Se si sospettano batteri anaerobi obbligati: conservare in un contenitore per trasporto anaerobico
Punti chiave per richiedere l’esame
Sezione intitolata “Punti chiave per richiedere l’esame”- Indicare chiaramente nel modulo di richiesta i reperti clinici e il microrganismo bersaglio. L’aggiunta di terreni selettivi migliora il tasso di rilevamento
- Se la quantità di campione è scarsa, indicare la priorità degli esami (ad esempio: coltura > microscopia, batteri > funghi)
Interpretazione del test di sensibilità ai farmaci
Sezione intitolata “Interpretazione del test di sensibilità ai farmaci”Nei test di sensibilità, spesso si sceglie il farmaco con MIC (concentrazione minima inibente) più bassa tra quelli giudicati S (sensibile). Tuttavia, anche se giudicato R (resistente), può essere clinicamente efficace, quindi è necessaria una valutazione complessiva. Si noti che per i test di sensibilità dei funghi e di Acanthamoeba non sono stati stabiliti criteri di interpretazione 1).
La percentuale di positività della coltura è del 37.6–74.3% e un risultato negativo non esclude l’infezione. Il fattore più influente è il momento del prelievo del campione; se il prelievo avviene dopo la somministrazione di antimicrobici, la positività si dimezza circa. Inoltre, la positività della coltura nei casi con striscio negativo è del 42.7–47.1%, mentre nei casi con striscio positivo è del 57.1–82.4%, perciò combinare i due esami migliora l’accuratezza diagnostica. Poiché Acanthamoeba è difficile da isolare e coltivare nelle strutture di base, va data priorità all’esame microscopico con colorazione Diff-Quik™ per confermare la struttura a doppia parete della cisti.
5. Esame degli eosinofili (diagnosi definitiva della malattia congiuntivale allergica)
Sezione intitolata “5. Esame degli eosinofili (diagnosi definitiva della malattia congiuntivale allergica)”
Per una diagnosi definitiva della malattia congiuntivale allergica, gli eosinofili devono essere rilevati in uno striscio di raschiamento congiuntivale colorato con Hansel 2).
Tecnica di prelievo
Sezione intitolata “Tecnica di prelievo”- Dopo anestesia topica, rovesciare la palpebra superiore
- Massaggiare delicatamente la congiuntiva palpebrale con una bacchetta di vetro e raccogliere con una pinza o una spatola il muco accumulato sulla superficie congiuntivale
- Stendere su un vetrino, eseguire la colorazione di Hansel e osservare al microscopio ottico
Interpretazione
Sezione intitolata “Interpretazione”Se al microscopio si riesce a osservare anche un solo eosinofilo, il risultato è considerato positivo e ciò porta alla diagnosi definitiva della malattia congiuntivale allergica2). Se durante il prelievo si osserva sanguinamento, gli eosinofili del sangue possono contaminare il campione, quindi l’esame va ripetuto nell’altro occhio.
Sistema diagnostico della malattia congiuntivale allergica
Sezione intitolata “Sistema diagnostico della malattia congiuntivale allergica”Le tre fasi diagnostiche basate sulla Linea guida per la gestione della malattia congiuntivale allergica (3a edizione) sono le seguenti2).
| Categoria diagnostica | Criteri necessari |
|---|---|
| Diagnosi clinica | Solo reperti clinici (sintomi e segni allergici) |
| Diagnosi clinica definitiva | Reperti clinici + conferma di predisposizione allergica (IgE totali nelle lacrime positive, test cutaneo, IgE sieriche specifiche per l’antigene positive) |
| Diagnosi definitiva | Reperti clinici + test degli eosinofili positivo (conferma di una reazione allergica locale oculare) |
La diagnosi clinica definitiva conferma solo una predisposizione allergica sistemica e non prova direttamente una reazione allergica nell’occhio. Solo quando il test degli eosinofili dimostra direttamente una reazione allergica locale oculare si parla di diagnosi definitiva2).
6. Interpretazione dei risultati degli esami e valutazione complessiva
Sezione intitolata “6. Interpretazione dei risultati degli esami e valutazione complessiva”Stima del patogeno in base al tipo di cellule infiammatorie
Sezione intitolata “Stima del patogeno in base al tipo di cellule infiammatorie”Anche quando non si trovano microrganismi, il tipo di cellule infiammatorie può fornire un indizio sul patogeno probabile.
- Prevalenza di neutrofili → suggerisce un’infezione batterica
- Prevalenza di linfociti → suggerisce un’infezione virale
- Prevalenza di eosinofili → suggerisce un’infezione allergica o parassitaria
Valutazione complessiva del germe causale
Sezione intitolata “Valutazione complessiva del germe causale”Stabilire se il microrganismo isolato sia il germe causale viene fatto in modo complessivo.
- Coerenza tra il risultato dell’esame microscopico e il microrganismo isolato in coltura (se il microrganismo visto al microscopio coincide con quello cresciuto in coltura)
- Coerenza con i reperti oculari (se il campione è stato prelevato dalla sede della lesione)
- Coerenza tra i risultati del test di sensibilità ai farmaci e l’effettiva risposta al trattamento
Attenzione ai patogeni particolari
Sezione intitolata “Attenzione ai patogeni particolari”- gonococco: è vulnerabile all’essiccamento e alle variazioni di temperatura, e muore facilmente. È essenziale l’elaborazione immediata dopo il prelievo. La conservazione in frigorifero non è adatta (conservare a temperatura ambiente)
- Acanthamoeba: l’isolamento e la coltura sono difficili nelle strutture generali. Con la colorazione Dif-Quik™, occorre dare priorità alla conferma di cisti a doppia parete
Combinazione di microscopia diretta su striscio ed esame colturale
Sezione intitolata “Combinazione di microscopia diretta su striscio ed esame colturale”Anche nei casi con microscopia diretta su striscio negativa, il tasso di positività della coltura può raggiungere il 42,7–47,1%1). D’altra parte, nei casi con striscio positivo, il tasso di positività della coltura è del 57,1–82,4%, e l’esecuzione simultanea di entrambi gli esami aumenta la sensibilità. L’esame PCR è utile come supporto alla microscopia diretta su striscio e alla coltura, ma non è raccomandato diagnosticare la cheratite batterica solo con la PCR1).
7. Ricerche più recenti e prospettive future
Sezione intitolata “7. Ricerche più recenti e prospettive future”- Analisi metagenomica (sequenziamento di nuova generazione): sta diventando possibile analizzare in modo completo il microbioma della superficie oculare, compresi i microrganismi non coltivabili. Si prevede di rilevare patogeni non identificabili con le tradizionali colture
- PCR multiplex: è in sviluppo sistemi in grado di rilevare rapidamente e contemporaneamente più patogeni (batteri, funghi, virus e Acanthamoeba) in un unico esame. Si prevede un miglioramento dell’accuratezza e della rapidità della diagnosi di cheratite infettiva3)
- Spettrometria di massa MALDI-TOF: tecnica di spettrometria di massa che può identificare i batteri coltivati in pochi minuti. Rispetto ai metodi biochimici tradizionali di identificazione, consente un notevole risparmio di tempo, e la sua applicazione alle infezioni oftalmiche è oggetto di studio4)
- Raffinamento della sensibilità e specificità dell’esame degli eosinofili: è in corso lo sviluppo di metodi ad alta sensibilità per la rilevazione degli eosinofili mediante microscopia elettronica e anticorpi marcati con fluorescenza. La colorazione di Hansel tradizionale presenta limiti nella sensibilità di rilevazione e, se verrà stabilito un metodo più sensibile, la precisione diagnostica potrebbe migliorare
8. Riferimenti
Sezione intitolata “8. Riferimenti”- 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.
- 日本眼科アレルギー学会診療ガイドライン作成委員会. アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2021;125(8):741-785.
- Liu HY, Hopping GC, Vaidyanathan U, Ronquillo YC, Hoopes PC, Moshirfar M. Polymerase Chain Reaction and Its Application in the Diagnosis of Infectious Keratitis. Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol. 2019;8(3):152-155. PMID:31598517; PMCID:PMC6778471.
- Taravati P, Lam D, Van Gelder RN. Role of molecular diagnostics in ocular microbiology. Curr Ophthalmol Rep. 2013;1(4):170-178.