Kính hiển vi đồng tiêu (Kính hiển vi đồng tiêu giác mạc in vivo)

Các điểm chính trong nháy mắt

Tóm tắt xét nghiệm này

• Kính hiển vi đồng tiêu giác mạc in vivo (IVCM) là phương pháp chẩn đoán hình ảnh không xâm lấn để quan sát giác mạc ở cấp độ tế bào.
• Đạt độ phân giải ngang 1-2 μm và độ phân giải sâu 4 μm, còn được gọi là “sinh thiết in vivo”.
• Các ứng dụng lâm sàng rộng rãi, bao gồm phát hiện sợi nấm trong viêm giác mạc do nấm, phát hiện Acanthamoeba và phân biệt loạn dưỡng giác mạc ⁵⁾⁸⁾.
• Có thể đánh giá tế bào nội mô ngay cả trong trường hợp phù giác mạc khó quan sát bằng kính hiển vi gương ⁷⁾.
• Đánh giá định lượng đám rối thần kinh dưới đáy đang ngày càng được sử dụng để phát hiện sớm rối loạn cảm giác giác mạc và bệnh tự miễn toàn thân ⁴⁾.

1. Kính hiển vi đồng tiêu là gì?

Kính hiển vi đồng tiêu là kính hiển vi độ phân giải cao dựa trên nguyên lý quang học rằng ánh sáng chiếu và ánh sáng quan sát chia sẻ cùng một mặt phẳng tiêu cự. Trong nhãn khoa, nó được ứng dụng để quan sát giác mạc in vivo, và cũng được sử dụng để đánh giá loạn dưỡng nội mô Fuchs ⁷⁾.

Các thiết bị chính hiện được sử dụng trong thực hành lâm sàng gồm hai loại sau:

Loại quét laser (HRT III-RCM): Do Heidelberg Engineering sản xuất. Sử dụng laser diode 670 nm làm nguồn sáng, vật kính 63 lần, trường nhìn 400 × 400 μm. Có độ phân giải ngang 1-2 μm và độ phân giải sâu khoảng 4 μm ¹⁾²⁾. Được sử dụng với nắp dùng một lần bằng PMMA (TomoCap) và gel nhãn khoa, tiếp xúc với giác mạc.

Loại quét khe (Confoscan 4): Do Nidek sản xuất. Sử dụng nguồn sáng halogen, có thể sử dụng không tiếp xúc. Có chức năng quét tự động, vận hành tương đối dễ dàng, nhưng độ phân giải sâu chỉ 25-27 μm. Hiện đã ngừng sản xuất.

IVCM có ba chế độ chụp ảnh. Quét mặt cắt chụp ảnh tĩnh ở một độ sâu duy nhất. Quét thể tích chụp 30-40 mặt cắt liên tiếp với khoảng cách 2 μm. Quét chuỗi chụp tới 100 khung hình video ở cùng một độ sâu, thích hợp để quan sát các thay đổi động.

Q Kính hiển vi đồng tiêu có thể được thực hiện ở bất kỳ cơ sở nào không?

A

IVCM yêu cầu thiết bị chuyên dụng và người vận hành có tay nghề cao, do đó chủ yếu được trang bị tại các bệnh viện đại học và trung tâm nhãn khoa chuyên khoa. Không phải phòng khám mắt nào cũng có, nhưng nó đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán nhiễm trùng giác mạc và loạn dưỡng giác mạc, và bệnh nhân được giới thiệu khi cần.

2. Các dấu hiệu chính và ý nghĩa lâm sàng

Đám rối thần kinh dưới đáy của giác mạc bình thường

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

Các sợi phản xạ cao mảnh chạy song song, duy trì sự sắp xếp bình thường của đám rối thần kinh dưới đáy. Đây là hình ảnh tham chiếu cho đường đi và mật độ sợi thần kinh.

Kết quả Giác mạc Bình thường

IVCM cho phép quan sát từng lớp giác mạc riêng lẻ.

Biểu mô giác mạc: Tế bào bề mặt có hình đa giác, kích thước 40–50 μm. Tế bào cánh có kích thước 20–30 μm với ranh giới tế bào rõ ràng, khoảng 5.000 tế bào/mm². Tế bào đáy có kích thước 8–10 μm với tế bào chất tối và ranh giới sáng (desmosome), thể hiện hình dạng tổ ong. Mật độ tế bào đáy là 3.600–8.996 tế bào/mm².

Màng Bowman: Được quan sát như một lớp màu xám không cấu trúc dày khoảng 10 μm. Các bó thần kinh chạy qua.

Nhu mô giác mạc: Tế bào nhu mô giác mạc (keratocyte) xuất hiện tối khi không hoạt động và sáng, hình amip khi hoạt động. Mật độ tế bào cao hơn ở nhu mô trước.

Màng Descemet: Được quan sát như một lớp mờ dày 6–10 μm. Cấu trúc tế bào thường không thể xác định.

Nội mô giác mạc: Các tế bào hình lục giác sắp xếp dạng khảm. Đường kính tế bào khoảng 20 μm, mật độ 2.550–2.720 tế bào/mm², giảm khoảng 0,6% mỗi năm theo tuổi.

Đám rối thần kinh dưới đáy: Được quan sát như các cấu trúc cong dạng chuỗi hạt chạy ngay dưới màng Bowman ³⁾. Tạo thành hình xoáy (whorl pattern) cách trung tâm giác mạc khoảng 1–2 mm về phía dưới mũi. Đường kính sợi là 0,52–4,6 μm.

Tế bào hình sao (Tế bào Langerhans): Phân bố với mật độ 34 ± 3 tế bào/mm² ở trung tâm giác mạc và 98 ± 8 tế bào/mm² ở ngoại vi. Là chỉ số của đáp ứng miễn dịch.

Kết quả Bất thường

Nhiễm trùng giác mạc: Trong viêm giác mạc do nấm, các sợi nấm dạng sợi được quan sát rõ trong nhu mô ⁸⁾. Acanthamoeba được phát hiện dưới dạng nang (hình cầu có vách kép), nhưng cần kinh nghiệm để phân biệt với tế bào viêm ⁸⁾. Vi khuẩn khó quan sát trực tiếp vì từng tế bào quá nhỏ ⁵⁾.

Loạn dưỡng giác mạc: Trong loạn dưỡng giác mạc Avellino (GCD2), có các lắng đọng dạng hạt tăng phản xạ ở lớp biểu mô đáy và các đám tăng phản xạ không đều ở nhu mô nông đến trung gian ¹⁾. Loạn dưỡng giác mạc dạng lưới type I đặc trưng bởi lắng đọng dạng lưới và các sợi phân nhánh ¹⁾. Loạn dưỡng giác mạc dạng đốm cho thấy lắng đọng không rõ ranh giới, và loạn dưỡng giác mạc tinh thể Schnyder biểu hiện các tinh thể hình kim ¹⁾.

Giãn giác mạc: Trong bệnh giác mạc hình chóp, có sự giảm mật độ keratocyte, tương quan với mức độ nặng. Cũng thấy đứt màng Bowman. Trong giãn giác mạc sau PRK, đặc trưng bởi khiếm khuyết màng Bowman và giảm keratocyte vùng trước, cho thấy hình ảnh IVCM khác với bệnh giác mạc hình chóp ²⁾.

3. Kỹ thuật và Phương pháp Xét nghiệm

Quy trình kiểm tra IVCM như sau:

Chuẩn bị trước: Nhỏ thuốc tê (như oxybuprocaine). Bôi gel mắt lên TomoCap dùng một lần (làm bằng PMMA) và gắn vào đầu vật kính.

Thực hiện kiểm tra: Làm phẳng giác mạc trong khi theo dõi tiếp xúc giữa thấu kính và giác mạc bằng camera CCD. Chỉnh tiêu cự bằng tay, quan sát tuần tự từ lớp bề mặt giác mạc (0 μm) đến lớp sâu. Cố định mắt rất quan trọng, sự hợp tác của bệnh nhân là cần thiết. Thời gian kiểm tra khoảng 5-15 phút.

Biến chứng: Hiếm khi xảy ra trầy xước biểu mô giác mạc, nhiễm trùng (nguy cơ cao nếu có sẵn khuyết tật biểu mô).

Mục	HRT III-RCM	Confoscan 4
Nguồn sáng	Laser diode	Đèn halogen
Độ phân giải chiều sâu	4 μm	25-27 μm
Tiếp xúc	Cần (TomoCap)	Cũng không cần

Q Kiểm tra IVCM có đau không?

A

Vì được gây tê bằng thuốc nhỏ mắt, hầu như không có đau trong quá trình kiểm tra. Chỉ có cảm giác chạm nhẹ của nắp lên giác mạc. Có thể xuất hiện cảm giác dị vật tạm thời sau kiểm tra, nhưng thường nhanh chóng biến mất.

4. Nguyên lý quang học và đặc điểm của thiết bị

Nguyên lý cơ bản của kính hiển vi đồng tiêu là “tính đồng tiêu” ⁷⁾. Cả hệ thống chiếu sáng và hệ thống phát hiện đều có lỗ kim, cho phép phát hiện chọn lọc chỉ ánh sáng phản xạ từ mặt phẳng tiêu cự của vật kính. Ánh sáng tán xạ từ bên ngoài mặt phẳng tiêu cự bị chặn bởi lỗ kim, mang lại độ tương phản cao và độ phân giải chiều sâu tốt.

Ở loại quét laser (HRT III-RCM), laser diode 670 nm hoạt động như nguồn sáng điểm, quét giác mạc từng điểm để xây dựng hình ảnh. Độ dày mặt phẳng tiêu cự (độ dày lát cắt quang học) rất mỏng, khoảng 4 μm, cung cấp hình ảnh cắt ngang rõ nét ở cấp độ tế bào.

Ở loại quét khe (Confoscan 4), quét được thực hiện bằng chùm sáng hình khe, do đó tính đồng tiêu thực sự chỉ đạt được theo hướng vuông góc với khe. Vì vậy, độ phân giải chiều sâu là 25-27 μm, và độ sắc nét hình ảnh kém hơn so với loại quét laser.

Các hạn chế của IVCM bao gồm: chỉ có hình ảnh thang độ xám (không quan sát màu), không thể phân giải cấu trúc nội bào, khó quan sát trong trường hợp đục giác mạc nặng, khó xác định chính xác vị trí quan sát, và phụ thuộc vào kỹ năng của người kiểm tra.

5. Ứng dụng lâm sàng chính

Các ứng dụng lâm sàng của IVCM rất đa dạng.

Hỗ trợ chẩn đoán nhiễm trùng giác mạc: Hữu ích như một bổ trợ cho xét nghiệm nuôi cấy. Có thể phát hiện sợi nấm và nang Acanthamoeba, nhưng việc giải thích kết quả đòi hỏi kiến thức chuyên môn ⁸⁾. Trong viêm giác mạc do herpes, có thể ghi nhận những thay đổi của dây thần kinh giác mạc ⁸⁾. Trong viêm nội mô giác mạc do cytomegalovirus, đôi khi thấy thể vùi mắt cú.

Phân biệt loạn dưỡng giác mạc: Mỗi loại loạn dưỡng có các dấu hiệu IVCM đặc trưng, cho phép phân biệt không xâm lấn dựa trên nhận dạng mẫu ¹⁾. Rất hữu ích như một sàng lọc trước khi xét nghiệm di truyền hoặc sinh thiết. Cũng có thể áp dụng để đánh giá hiệu quả sau điều trị (PTK, DALK, v.v.) ¹⁾.

Đánh giá suy tế bào gốc vùng rìa (LSCD): Chẩn đoán dựa trên sự biến mất của cấu trúc hàng rào Vogt, sự thay thế biểu mô giác mạc bằng biểu mô kết mạc, và sự xuất hiện của tế bào đài ⁶⁾. Mật độ tế bào biểu mô đáy có thể được đo để đánh giá định lượng mức độ nghiêm trọng của LSCD ⁶⁾.

Đánh giá phù giác mạc và bệnh nội mô: IVCM có thể quan sát tế bào nội mô ngay cả qua phù giác mạc mức độ trung bình, do đó đặc biệt hữu ích trong các trường hợp khó chụp bằng kính hiển vi đặc điểm ⁷⁾. Trong loạn dưỡng nội mô giác mạc Fuchs (FECD), ngoài đánh giá tế bào nội mô, còn có thể ghi nhận sự giảm mật độ dây thần kinh và thay đổi mật độ tế bào hình tua ⁷⁾.

Đánh giá thần kinh giác mạc: Đánh giá định lượng đám rối thần kinh dưới đáy được sử dụng để chẩn đoán viêm giác mạc thần kinh và đánh giá hiệu quả điều trị ³⁾. Sau phẫu thuật tái tạo thần kinh giác mạc (surgical corneal neurotization), IVCM cho thấy dấu hiệu tái tạo thần kinh từ 6 tháng đến 1 năm sau phẫu thuật ³⁾.

Phát hiện sớm bệnh tự miễn toàn thân: Trong hội chứng Sjögren, sự giảm mật độ sợi thần kinh ở trung tâm giác mạc và tăng tế bào đuôi gai hoạt hóa có thể được phát hiện trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng ⁴⁾. Nếu có hai hoặc nhiều tế bào đuôi gai hoạt hóa với ba hoặc nhiều nhánh ở trung tâm giác mạc, độ nhạy 60% và độ đặc hiệu 77% đã được báo cáo đối với bệnh miễn dịch toàn thân ⁴⁾.

Đánh giá sau phẫu thuật: Được sử dụng để theo dõi các thay đổi ở rìa vạt và màng Bowman sau LASIK và PRK, cũng như theo dõi quá trình tái tạo thần kinh ²⁾. Cũng được áp dụng để phát hiện sớm phản ứng thải ghép sau ghép giác mạc.

6. Nghiên cứu mới nhất và triển vọng tương lai

Phân tích hình ảnh tự động: Các hệ thống định lượng tự động cho sợi thần kinh dưới đáy đã được phát triển, như phần mềm ACCMetrics ²⁾. Các thông số như mật độ sợi thần kinh, mật độ phân nhánh và độ xoắn được tính toán khách quan, giảm sự khác biệt giữa các người đánh giá.

Phát hiện giai đoạn tiền lâm sàng của bệnh: Trong các trường hợp hội chứng Sjögren, đã có báo cáo về việc phát hiện bất thường trên IVCM vài năm trước khi chuyển đổi huyết thanh kháng thể hoặc xuất hiện triệu chứng lâm sàng ⁴⁾. Điều này cho thấy tiềm năng của IVCM như một công cụ sàng lọc bệnh tự miễn.

Phân loại phân nhóm khô mắt: Bằng cách phân tích hình thái và mô hình phân bố của tế bào đuôi gai, có thể phân biệt giữa khô mắt qua trung gian miễn dịch và khô mắt do bay hơi ⁴⁾.

Theo dõi tái tạo thần kinh sau phẫu thuật: Các nghiên cứu đang được tiến hành để theo dõi quá trình tái tạo thần kinh sau phẫu thuật tái tạo thần kinh giác mạc hoặc cross-linking giác mạc bằng IVCM theo thời gian ³⁾. Trong tương lai, nó được kỳ vọng sẽ được sử dụng như một điểm cuối khách quan để đánh giá hiệu quả điều trị.

Tích hợp trí tuệ nhân tạo: Các hệ thống phân loại và chẩn đoán tự động hình ảnh IVCM sử dụng học sâu đang được phát triển, với ứng dụng dự kiến trong chẩn đoán nhanh nhiễm trùng và phân biệt tự động các chứng loạn dưỡng giác mạc.

Tuyên bố miễn trừ trách nhiệm về thông tin y tế

Nội dung bài viết này không thay thế cho chẩn đoán hoặc điều trị của chuyên gia y tế. Nếu bạn có bất thường về mắt, hãy tham khảo ý kiến bác sĩ nhãn khoa.

7. Tài liệu tham khảo

1. Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.

2. Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.

3. Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.

4. Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.

5. Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.

6. Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.

7. Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.

8. 日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.