กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลกระจกตาในร่างกาย)

ประเด็นสำคัญโดยสังเขป

สรุปการตรวจนี้

• กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลกระจกตาในร่างกาย (IVCM) เป็นวิธีการตรวจวินิจฉัยด้วยภาพแบบไม่รุกรานเพื่อสังเกตกระจกตาในระดับเซลล์
• มีความละเอียดด้านข้าง 1-2 ไมโครเมตร และความละเอียดเชิงลึก 4 ไมโครเมตร เรียกอีกอย่างว่า “การตัดชิ้นเนื้อในร่างกาย”
• การประยุกต์ใช้ทางคลินิกมีหลากหลาย รวมถึงการตรวจหาเส้นใยราในกระจกตาอักเสบจากเชื้อรา การตรวจหา Acanthamoeba และการแยกความแตกต่างของกระจกตาเสื่อม ⁵⁾⁸⁾
• สามารถประเมินเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาได้แม้ในกรณีกระจกตาบวมน้ำที่ยากต่อการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์สเปคคูลาร์ ⁷⁾
• การประเมินเชิงปริมาณของข่ายประสาทใต้ฐานกำลังถูกใช้มากขึ้นในการตรวจหาความผิดปกติของความรู้สึกที่กระจกตาและโรคภูมิต้านตนเองทั่วร่างกายในระยะเริ่มต้น ⁴⁾

1. กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคืออะไร?

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงที่อาศัยหลักการทางแสงที่ว่าแสงส่องสว่างและแสงที่สังเกตร่วมกันมีระนาบโฟกัสเดียวกัน ในจักษุวิทยา ใช้สำหรับสังเกตกระจกตาในร่างกาย และยังใช้ในการประเมินกระจกตาเสื่อมชนิด Fuchs endothelial dystrophy ⁷⁾

อุปกรณ์หลักที่ใช้ในทางคลินิกปัจจุบันมีสองประเภทดังนี้:

ชนิดสแกนด้วยเลเซอร์ (HRT III-RCM): ผลิตโดย Heidelberg Engineering ใช้เลเซอร์ไดโอด 670 นาโนเมตรเป็นแหล่งกำเนิดแสง เลนส์วัตถุ 63 เท่า ขอบเขตการมองเห็น 400 × 400 ไมโครเมตร มีความละเอียดด้านข้าง 1-2 ไมโครเมตร และความละเอียดเชิงลึกประมาณ 4 ไมโครเมตร ¹⁾²⁾ ใช้ร่วมกับฝาครอบแบบใช้แล้วทิ้งที่ทำจาก PMMA (TomoCap) และเจลสำหรับจักษุ สัมผัสกับกระจกตา

ชนิดสแกนแบบกรีด (Confoscan 4): ผลิตโดย Nidek ใช้แหล่งกำเนิดแสงฮาโลเจน สามารถใช้แบบไม่สัมผัส มีฟังก์ชันสแกนอัตโนมัติ ใช้งานค่อนข้างง่าย แต่ความละเอียดเชิงลึกเพียง 25-27 ไมโครเมตร ปัจจุบันหยุดผลิตแล้ว

IVCM มีโหมดการถ่ายภาพสามโหมด การสแกนส่วน ถ่ายภาพนิ่งที่ความลึกเดียว การสแกนปริมาตร ถ่ายภาพต่อเนื่อง 30-40 ส่วนที่ระยะห่าง 2 ไมโครเมตร การสแกนลำดับ ถ่ายวิดีโอสูงสุด 100 เฟรมที่ความลึกเดียวกัน เหมาะสำหรับสังเกตการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิก

Q การตรวจกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสามารถทำได้ที่สถานพยาบาลทุกแห่งหรือไม่?

A

IVCM ต้องใช้อุปกรณ์เฉพาะและผู้ตรวจที่มีความชำนาญ ดังนั้นจึงติดตั้งเป็นหลักในโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยและศูนย์จักษุวิทยาเฉพาะทาง ไม่มีให้บริการในคลินิกตาทุกแห่ง แต่มีประโยชน์อย่างยิ่งในการวินิจฉัยการติดเชื้อที่กระจกตาและกระจกตาเสื่อม และผู้ป่วยจะถูกส่งต่อเมื่อจำเป็น

2. ผลการตรวจหลักและความสำคัญทางคลินิก

ข่ายประสาทใต้ฐานของกระจกตาปกติ

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

เส้นใยสะท้อนแสงสูงบางๆ เรียงตัวขนานกัน คงการจัดเรียงปกติของข่ายประสาทใต้ฐาน (subbasal nerve plexus) เป็นภาพอ้างอิงสำหรับแนวเดินและความหนาแน่นของเส้นใยประสาท

ผลการตรวจกระจกตาปกติ

IVCM ช่วยให้สังเกตแต่ละชั้นของกระจกตาได้แยกกัน

เยื่อบุกระจกตา: เซลล์ผิวมีรูปหลายเหลี่ยม ขนาด 40–50 ไมโครเมตร เซลล์ปีกมีขนาด 20–30 ไมโครเมตร มีขอบเขตเซลล์ชัดเจน ประมาณ 5,000 เซลล์/ตร.มม. เซลล์ฐานมีขนาด 8–10 ไมโครเมตร มีไซโทพลาซึมสีเข้มและขอบสว่าง (เดสโมโซม) แสดงรูปแบบรังผึ้ง ความหนาแน่นของเซลล์ฐานคือ 3,600–8,996 เซลล์/ตร.มม.

เยื่อโบว์แมน: สังเกตเป็นชั้นสีเทาไม่มีโครงสร้างหนาประมาณ 10 ไมโครเมตร มีมัดประสาทวิ่งผ่าน

สโตรมาของกระจกตา: เซลล์สโตรมาของกระจกตา (เคอราโทไซต์) ปรากฏเป็นสีเข้มเมื่อไม่ทำงาน และสว่างเป็นรูปอะมีบาเมื่อถูกกระตุ้น ความหนาแน่นของเซลล์สูงกว่าในสโตรมาส่วนหน้า

เยื่อเดสเซเมต: สังเกตเป็นชั้นขุ่นมัวหนา 6–10 ไมโครเมตร โดยปกติไม่สามารถระบุโครงสร้างเซลล์ได้

เอ็นโดทีเลียมของกระจกตา: เซลล์รูปหกเหลี่ยมเรียงตัวแบบโมเสก เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ประมาณ 20 ไมโครเมตร ความหนาแน่น 2,550–2,720 เซลล์/ตร.มม. ลดลงประมาณ 0.6% ต่อปีตามอายุ

ข่ายประสาทใต้ฐาน: สังเกตเป็นโครงสร้างโค้งคล้ายลูกปัดที่วิ่งอยู่ใต้เยื่อโบว์แมนโดยตรง ³⁾ ก่อตัวเป็นรูปแบบก้นหอย (whorl pattern) ห่างจากศูนย์กลางกระจกตาประมาณ 1–2 มม. ทางด้านล่าง-จมูก เส้นผ่านศูนย์กลางเส้นใย 0.52–4.6 ไมโครเมตร

เซลล์เดนไดรต์ (เซลล์แลงเกอร์ฮานส์): กระจายตัว 34 ± 3 เซลล์/ตร.มม. ที่ศูนย์กลางกระจกตา และ 98 ± 8 เซลล์/ตร.มม. ที่รอบนอก เป็นตัวบ่งชี้การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน

ผลการตรวจที่ผิดปกติ

การติดเชื้อที่กระจกตา: ในโรคกระจกตาอักเสบจากเชื้อรา จะสังเกตเห็นเส้นใยราแบบเส้นใยชัดเจนในสโตรมา ⁸⁾ อะแคนทามีบาถูกตรวจพบเป็นซีสต์ (ทรงกลมผนังสองชั้น) แต่ต้องอาศัยประสบการณ์ในการแยกจากเซลล์อักเสบ ⁸⁾ แบคทีเรียยากต่อการมองเห็นโดยตรงเนื่องจากเซลล์เดี่ยวมีขนาดเล็กเกินไป ⁵⁾

โรคกระจกตาเสื่อม: ในโรคกระจกตาเสื่อมชนิด Avellino (GCD2) มีการสะสมแบบเม็ดสะท้อนแสงสูงในชั้นเยื่อบุฐาน และกลุ่มก้อนสะท้อนแสงสูงรูปไม่สม่ำเสมอในสโตรมาชั้นตื้นถึงกลาง ¹⁾ โรคกระจกตาเสื่อมชนิดร่างแห type I มีลักษณะเฉพาะคือการสะสมแบบร่างแหและเส้นใยที่แตกแขนง ¹⁾ โรคกระจกตาเสื่อมชนิดจุดด่างแสดงการสะสมที่มีขอบเขตไม่ชัดเจน และโรคกระจกตาเสื่อมชนิดผลึก Schnyder แสดงผลึกรูปเข็ม ¹⁾

ภาวะกระจกตาโป่งพอง: ในโรคกระจกตารูปกรวย มีความหนาแน่นของเคอราโทไซต์ลดลง ซึ่งสัมพันธ์กับความรุนแรง นอกจากนี้ยังพบการฉีกขาดของเยื่อโบว์แมน ในภาวะกระจกตาโป่งพองหลัง PRK มีลักษณะเฉพาะคือความบกพร่องของเยื่อโบว์แมนและการลดลงของเคอราโทไซต์ส่วนหน้า ซึ่งแสดงรูปแบบ IVCM ที่แตกต่างจากโรคกระจกตารูปกรวย ²⁾

3. เทคนิคและวิธีการตรวจ

ขั้นตอนการตรวจ IVCM มีดังนี้:

การเตรียมก่อน: หยอดยาชาเฉพาะที่ (เช่น ออกซิบูโปรเคน) ทาเจลสำหรับตาบน TomoCap แบบใช้แล้วทิ้ง (ทำจาก PMMA) และติดตั้งที่ปลายเลนส์วัตถุ

การตรวจ: กดกระจกตาแบบแอปพลาเนชันขณะตรวจสอบการสัมผัสระหว่างเลนส์กับกระจกตาด้วยกล้อง CCD ปรับโฟกัสด้วยมือ สังเกตตามลำดับจากชั้นผิวกระจกตา (0 ไมครอน) ไปยังชั้นลึก การจ้องตาคงที่สำคัญมาก ความร่วมมือของผู้รับการตรวจจำเป็น ระยะเวลาการตรวจประมาณ 5-15 นาที

ภาวะแทรกซ้อน: อาจเกิดการถลอกของเยื่อบุกระจกตา การติดเชื้อ (ความเสี่ยงสูงหากมีข้อบกพร่องของเยื่อบุอยู่ก่อน) ได้น้อยครั้ง

รายการ	HRT III-RCM	Confoscan 4
แหล่งกำเนิดแสง	เลเซอร์ไดโอด	แสงฮาโลเจน
ความละเอียดเชิงลึก	4 ไมครอน	25-27 ไมครอน
การสัมผัส	จำเป็น (TomoCap)	ไม่จำเป็นก็ได้

Q การตรวจ IVCM เจ็บหรือไม่?

A

เนื่องจากใช้ยาชาหยอดตา จึงแทบไม่มีความเจ็บปวดระหว่างการตรวจ มีเพียงความรู้สึกสัมผัสเบาๆ ของฝาครอบกับกระจกตา อาจมีอาการระคายเคืองชั่วคราวหลังการตรวจ แต่โดยทั่วไปจะหายไปอย่างรวดเร็ว

4. หลักการทางแสงและลักษณะเฉพาะของอุปกรณ์

หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคือ “การเป็นคอนโฟคอล” ⁷⁾ ทั้งระบบให้แสงและระบบตรวจจับมีรูเข็ม ทำให้สามารถตรวจจับเฉพาะแสงที่สะท้อนจากระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุได้อย่างเลือกสรร แสงกระเจิงจากภายนอกระนาบโฟกัสจะถูกกั้นโดยรูเข็ม ทำให้ได้คอนทราสต์สูงและความละเอียดเชิงลึกที่ดี

ในชนิดสแกนด้วยเลเซอร์ (HRT III-RCM) เลเซอร์ไดโอด 670 นาโนเมตรทำหน้าที่เป็นแหล่งกำเนิดแสงจุด สแกนกระจกตาทีละจุดเพื่อสร้างภาพ ความหนาของระนาบโฟกัส (ความหนาของภาพตัดขวางทางแสง) บางมากประมาณ 4 ไมโครเมตร ให้ภาพตัดขวางที่ชัดเจนในระดับเซลล์

ในชนิดสแกนด้วยช่องแสง (Confoscan 4) การสแกนทำด้วยลำแสงรูปช่อง ดังนั้นการเป็นคอนโฟคอลที่แท้จริงจะเกิดขึ้นเฉพาะในทิศทางตั้งฉากกับช่องแสงเท่านั้น ดังนั้นความละเอียดเชิงลึกคือ 25-27 ไมโครเมตร และความคมชัดของภาพด้อยกว่าชนิดสแกนด้วยเลเซอร์

ข้อจำกัดของ IVCM ได้แก่: ได้เฉพาะภาพระดับสีเทา (ไม่สามารถสังเกตสีได้), ไม่สามารถแยกแยะโครงสร้างภายในเซลล์, สังเกตได้ยากในกรณีกระจกตาขุ่นมัวรุนแรง, ยากต่อการระบุตำแหน่งที่สังเกตได้อย่างแม่นยำ, และขึ้นอยู่กับทักษะของผู้ตรวจ

5. การประยุกต์ใช้ทางคลินิกหลัก

การประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ IVCM มีหลากหลาย

การช่วยวินิจฉัยการติดเชื้อที่กระจกตา: มีประโยชน์เป็นส่วนเสริมของการตรวจเพาะเชื้อ สามารถตรวจพบเส้นใยของเชื้อราและซีสต์ของอะแคนทามีบา แต่การแปลผลต้องอาศัยความรู้เฉพาะทาง ⁸⁾ ในโรคเยื่อบุกระจกตาอักเสบจากเริม สามารถจับการเปลี่ยนแปลงของเส้นประสาทกระจกตาได้ ⁸⁾ ในโรคเยื่อบุผนังกระจกตาอักเสบจากไซโตเมกาโลไวรัส อาจพบ owl’s eye inclusion body

การแยกโรคกระจกตาเสื่อม: โรคกระจกตาเสื่อมแต่ละชนิดมีลักษณะเฉพาะที่พบได้จาก IVCM ทำให้สามารถแยกโรคแบบไม่รุกล้ำโดยการจดจำรูปแบบ ¹⁾ มีประโยชน์สูงในการคัดกรองก่อนการตรวจทางพันธุกรรมหรือการตัดชิ้นเนื้อ นอกจากนี้ยังสามารถประยุกต์ใช้ในการประเมินผลหลังการรักษา (PTK, DALK ฯลฯ) ¹⁾

การประเมินภาวะพร่องสเต็มเซลล์บริเวณลิมบัส (LSCD): การวินิจฉัยขึ้นอยู่กับการหายไปของโครงสร้างรั้ว Vogt, การแทนที่ของเยื่อบุกระจกตาด้วยเยื่อบุตาขาว, และการปรากฏของเซลล์กุณโฑ ⁶⁾ สามารถวัดความหนาแน่นของเซลล์เยื่อบุฐานเพื่อประเมินความรุนแรงของ LSCD ในเชิงปริมาณ ⁶⁾

การประเมินอาการบวมน้ำที่กระจกตาและโรคเยื่อบุผนังกระจกตา: IVCM สามารถสังเกตเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาได้แม้ผ่านกระจกตาที่บวมน้ำระดับปานกลาง จึงมีประโยชน์อย่างยิ่งในกรณีที่กล้องจุลทรรศน์สเปคคูลาร์ถ่ายภาพได้ยาก ⁷⁾ ในโรคกระจกตาเสื่อมฟุคส์ (FECD) นอกจากการประเมินเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาแล้ว ยังสามารถจับการลดลงของความหนาแน่นเส้นประสาทและการเปลี่ยนแปลงความหนาแน่นของเซลล์เดนไดรต์ ⁷⁾

การประเมินเส้นประสาทกระจกตา: การประเมินเชิงปริมาณของข่ายประสาทใต้ฐาน (subbasal nerve plexus) ใช้ในการวินิจฉัยโรคกระจกตาอักเสบจากเส้นประสาทเสื่อม (neurotrophic keratitis) และประเมินประสิทธิภาพการรักษา ³⁾ หลังการผ่าตัดฟื้นฟูเส้นประสาทกระจกตา (surgical corneal neurotization) การตรวจ IVCM จะพบสัญญาณของการสร้างเส้นประสาทใหม่ในช่วง 6 เดือนถึง 1 ปีหลังผ่าตัด ³⁾

การตรวจพบโรคภูมิต้านตนเองทั่วร่างกายในระยะเริ่มต้น: ในกลุ่มอาการโจเกรน (Sjögren’s syndrome) การลดลงของความหนาแน่นเส้นใยประสาทบริเวณกลางกระจกตาและการเพิ่มขึ้นของเซลล์เดนไดรต์ที่ถูกกระตุ้นสามารถตรวจพบได้ก่อนการแสดงอาการทางคลินิก ⁴⁾ หากพบเซลล์เดนไดรต์ที่ถูกกระตุ้นตั้งแต่ 2 เซลล์ขึ้นไปซึ่งมีส่วนยื่นตั้งแต่ 3 เส้นขึ้นไปบริเวณกลางกระจกตา มีรายงานความไว 60% และความจำเพาะ 77% สำหรับโรคภูมิคุ้มกันทั่วร่างกาย ⁴⁾

การประเมินหลังผ่าตัด: ใช้ในการติดตามการเปลี่ยนแปลงของขอบแผ่นปิดและเยื่อโบว์แมนหลังการทำ LASIK และ PRK รวมถึงการติดตามการสร้างเส้นประสาทใหม่ ²⁾ นอกจากนี้ยังใช้ในการตรวจหาการปฏิเสธการปลูกถ่ายกระจกตาในระยะเริ่มต้น

6. งานวิจัยล่าสุดและแนวโน้มในอนาคต

การวิเคราะห์ภาพอัตโนมัติ: ได้มีการพัฒนาระบบวัดปริมาณเส้นใยประสาทใต้ฐานอัตโนมัติ เช่น ซอฟต์แวร์ ACCMetrics ²⁾ ระบบจะคำนวณค่าพารามิเตอร์ต่างๆ เช่น ความหนาแน่นเส้นใยประสาท ความหนาแน่นของการแตกแขนง และความคดเคี้ยวอย่างเป็นกลาง ช่วยลดความแปรปรวนระหว่างผู้ตรวจ

การตรวจหาระยะก่อนแสดงอาการของโรค: ในผู้ป่วยกลุ่มอาการโจเกรน มีรายงานการตรวจพบความผิดปกติของ IVCM หลายปีก่อนที่แอนติบอดีจะเปลี่ยนเป็นบวกหรือมีอาการทางคลินิก ⁴⁾ สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า IVCM อาจเป็นเครื่องมือคัดกรองโรคภูมิต้านตนเอง

การจำแนกชนิดย่อยของโรคตาแห้ง: โดยการวิเคราะห์รูปร่างและรูปแบบการกระจายของเซลล์เดนไดรต์ อาจสามารถแยกความแตกต่างระหว่างตาแห้งที่เกิดจากภูมิคุ้มกันและตาแห้งชนิดระเหยเพิ่มขึ้น ⁴⁾

การติดตามการสร้างเส้นประสาทใหม่หลังผ่าตัด: กำลังมีการวิจัยเพื่อติดตามกระบวนการสร้างเส้นประสาทใหม่หลังการผ่าตัดฟื้นฟูเส้นประสาทกระจกตาหรือการเชื่อมขวางกระจกตาโดยใช้ IVCM ตามช่วงเวลา ³⁾ ในอนาคต คาดว่าจะถูกใช้เป็นจุดสิ้นสุดเชิงวัตถุประสงค์สำหรับการประเมินประสิทธิภาพการรักษา

การบูรณาการปัญญาประดิษฐ์: กำลังมีการพัฒนาระบบจำแนกและวินิจฉัยภาพ IVCM อัตโนมัติโดยใช้การเรียนรู้เชิงลึก ซึ่งคาดว่าจะนำไปประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยการติดเชื้ออย่างรวดเร็วและการแยกแยะโรคกระจกตาเสื่อมโดยอัตโนมัติ

ข้อจำกัดความรับผิดชอบเกี่ยวกับข้อมูลทางการแพทย์

เนื้อหาในบทความนี้ไม่สามารถใช้แทนการวินิจฉัยหรือการรักษาจากผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์ หากคุณมีความผิดปกติทางตา ควรปรึกษาจักษุแพทย์

7. เอกสารอ้างอิง

1. Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.

2. Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.

3. Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.

4. Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.

5. Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.

6. Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.

7. Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.

8. 日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.