กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลกระจกตาในร่างกาย)

ประเด็นสำคัญโดยสังเขป

สรุปการตรวจนี้

• กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลกระจกตาในร่างกาย (IVCM) เป็นวิธีการตรวจวินิจฉัยด้วยภาพแบบไม่รุกรานเพื่อสังเกตกระจกตาในระดับเซลล์
• มีความละเอียดด้านข้าง 1-2 ไมโครเมตร และความละเอียดเชิงลึก 4 ไมโครเมตร เรียกอีกอย่างว่า “การตัดชิ้นเนื้อในร่างกาย”
• การประยุกต์ใช้ทางคลินิกมีหลากหลาย รวมถึงการตรวจหาเส้นใยราในกระจกตาอักเสบจากเชื้อรา การตรวจหา Acanthamoeba และการแยกความแตกต่างของกระจกตาเสื่อม ⁵⁾⁸⁾
• สามารถประเมินเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาได้แม้ในกรณีกระจกตาบวมน้ำที่ยากต่อการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์สเปคคูลาร์ ⁷⁾
• การประเมินเชิงปริมาณของข่ายประสาทใต้ฐานกำลังถูกใช้มากขึ้นในการตรวจหาความผิดปกติของความรู้สึกที่กระจกตาและโรคภูมิต้านตนเองทั่วร่างกายในระยะเริ่มต้น ⁴⁾

1. กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคืออะไร?

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงที่อาศัยหลักการทางแสงที่ว่าแสงส่องสว่างและแสงที่สังเกตร่วมกันมีระนาบโฟกัสเดียวกัน ในจักษุวิทยา ใช้สำหรับสังเกตกระจกตาในร่างกาย และยังใช้ในการประเมินกระจกตาเสื่อมชนิด Fuchs endothelial dystrophy ⁷⁾

อุปกรณ์หลักที่ใช้ในทางคลินิกปัจจุบันมีสองประเภทดังนี้:

ชนิดสแกนด้วยเลเซอร์ (HRT III-RCM): ผลิตโดย Heidelberg Engineering ใช้เลเซอร์ไดโอด 670 นาโนเมตรเป็นแหล่งกำเนิดแสง เลนส์วัตถุ 63 เท่า ขอบเขตการมองเห็น 400 × 400 ไมโครเมตร มีความละเอียดด้านข้าง 1-2 ไมโครเมตร และความละเอียดเชิงลึกประมาณ 4 ไมโครเมตร ¹⁾²⁾ ใช้ร่วมกับฝาครอบแบบใช้แล้วทิ้งที่ทำจาก PMMA (TomoCap) และเจลสำหรับจักษุ สัมผัสกับกระจกตา

ชนิดสแกนแบบกรีด (Confoscan 4): ผลิตโดย Nidek ใช้แหล่งกำเนิดแสงฮาโลเจน สามารถใช้แบบไม่สัมผัส มีฟังก์ชันสแกนอัตโนมัติ ใช้งานค่อนข้างง่าย แต่ความละเอียดเชิงลึกเพียง 25-27 ไมโครเมตร ปัจจุบันหยุดผลิตแล้ว

IVCM มีโหมดการถ่ายภาพสามโหมด การสแกนส่วน ถ่ายภาพนิ่งที่ความลึกเดียว การสแกนปริมาตร ถ่ายภาพต่อเนื่อง 30-40 ส่วนที่ระยะห่าง 2 ไมโครเมตร การสแกนลำดับ ถ่ายวิดีโอสูงสุด 100 เฟรมที่ความลึกเดียวกัน เหมาะสำหรับสังเกตการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิก

Q การตรวจกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสามารถทำได้ที่สถานพยาบาลทุกแห่งหรือไม่?

A

IVCM ต้องใช้อุปกรณ์เฉพาะและผู้ตรวจที่มีความชำนาญ ดังนั้นจึงติดตั้งเป็นหลักในโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยและศูนย์จักษุวิทยาเฉพาะทาง ไม่มีให้บริการในคลินิกตาทุกแห่ง แต่มีประโยชน์อย่างยิ่งในการวินิจฉัยการติดเชื้อที่กระจกตาและกระจกตาเสื่อม และผู้ป่วยจะถูกส่งต่อเมื่อจำเป็น

2. ผลการตรวจหลักและความสำคัญทางคลินิก

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

เส้นใยสะท้อนแสงสูงบางๆ เรียงตัวขนานกัน คงการจัดเรียงปกติของข่ายประสาทใต้ฐาน (subbasal nerve plexus) เป็นภาพอ้างอิงสำหรับแนวเดินและความหนาแน่นของเส้นใยประสาท

ผลการตรวจกระจกตาปกติ

IVCM ช่วยให้สังเกตแต่ละชั้นของกระจกตาได้แยกกัน

เยื่อบุกระจกตา: เซลล์ผิวมีรูปหลายเหลี่ยม ขนาด 40–50 ไมโครเมตร เซลล์ปีกมีขนาด 20–30 ไมโครเมตร มีขอบเขตเซลล์ชัดเจน ประมาณ 5,000 เซลล์/ตร.มม. เซลล์ฐานมีขนาด 8–10 ไมโครเมตร มีไซโทพลาซึมสีเข้มและขอบสว่าง (เดสโมโซม) แสดงรูปแบบรังผึ้ง ความหนาแน่นของเซลล์ฐานคือ 3,600–8,996 เซลล์/ตร.มม.

เยื่อโบว์แมน: สังเกตเป็นชั้นสีเทาไม่มีโครงสร้างหนาประมาณ 10 ไมโครเมตร มีมัดประสาทวิ่งผ่าน

สโตรมาของกระจกตา: เซลล์สโตรมาของกระจกตา (เคอราโทไซต์) ปรากฏเป็นสีเข้มเมื่อไม่ทำงาน และสว่างเป็นรูปอะมีบาเมื่อถูกกระตุ้น ความหนาแน่นของเซลล์สูงกว่าในสโตรมาส่วนหน้า

เยื่อเดสเซเมต: สังเกตเป็นชั้นขุ่นมัวหนา 6–10 ไมโครเมตร โดยปกติไม่สามารถระบุโครงสร้างเซลล์ได้

เอ็นโดทีเลียมของกระจกตา: เซลล์รูปหกเหลี่ยมเรียงตัวแบบโมเสก เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ประมาณ 20 ไมโครเมตร ความหนาแน่น 2,550–2,720 เซลล์/ตร.มม. ลดลงประมาณ 0.6% ต่อปีตามอายุ

ข่ายประสาทใต้ฐาน: สังเกตเป็นโครงสร้างโค้งคล้ายลูกปัดที่วิ่งอยู่ใต้เยื่อโบว์แมนโดยตรง ³⁾ ก่อตัวเป็นรูปแบบก้นหอย (whorl pattern) ห่างจากศูนย์กลางกระจกตาประมาณ 1–2 มม. ทางด้านล่าง-จมูก เส้นผ่านศูนย์กลางเส้นใย 0.52–4.6 ไมโครเมตร

เซลล์เดนไดรต์ (เซลล์แลงเกอร์ฮานส์): กระจายตัว 34 ± 3 เซลล์/ตร.มม. ที่ศูนย์กลางกระจกตา และ 98 ± 8 เซลล์/ตร.มม. ที่รอบนอก เป็นตัวบ่งชี้การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน

ผลการตรวจที่ผิดปกติ

การติดเชื้อที่กระจกตา: ในโรคกระจกตาอักเสบจากเชื้อรา จะสังเกตเห็นเส้นใยราแบบเส้นใยชัดเจนในสโตรมา ⁸⁾ อะแคนทามีบาถูกตรวจพบเป็นซีสต์ (ทรงกลมผนังสองชั้น) แต่ต้องอาศัยประสบการณ์ในการแยกจากเซลล์อักเสบ ⁸⁾ แบคทีเรียยากต่อการมองเห็นโดยตรงเนื่องจากเซลล์เดี่ยวมีขนาดเล็กเกินไป ⁵⁾

โรคกระจกตาเสื่อม: ในโรคกระจกตาเสื่อมชนิด Avellino (GCD2) มีการสะสมแบบเม็ดสะท้อนแสงสูงในชั้นเยื่อบุฐาน และกลุ่มก้อนสะท้อนแสงสูงรูปไม่สม่ำเสมอในสโตรมาชั้นตื้นถึงกลาง ¹⁾ โรคกระจกตาเสื่อมชนิดร่างแห type I มีลักษณะเฉพาะคือการสะสมแบบร่างแหและเส้นใยที่แตกแขนง ¹⁾ โรคกระจกตาเสื่อมชนิดจุดด่างแสดงการสะสมที่มีขอบเขตไม่ชัดเจน และโรคกระจกตาเสื่อมชนิดผลึก Schnyder แสดงผลึกรูปเข็ม ¹⁾

ภาวะกระจกตาโป่งพอง: ในโรคกระจกตารูปกรวย มีความหนาแน่นของเคอราโทไซต์ลดลง ซึ่งสัมพันธ์กับความรุนแรง นอกจากนี้ยังพบการฉีกขาดของเยื่อโบว์แมน ในภาวะกระจกตาโป่งพองหลัง PRK มีลักษณะเฉพาะคือความบกพร่องของเยื่อโบว์แมนและการลดลงของเคอราโทไซต์ส่วนหน้า ซึ่งแสดงรูปแบบ IVCM ที่แตกต่างจากโรคกระจกตารูปกรวย ²⁾

3. เทคนิคและวิธีการตรวจ

ขั้นตอนการตรวจ IVCM มีดังนี้:

การเตรียมก่อน: หยอดยาชาเฉพาะที่ (เช่น ออกซิบูโปรเคน) ทาเจลสำหรับตาบน TomoCap แบบใช้แล้วทิ้ง (ทำจาก PMMA) และติดตั้งที่ปลายเลนส์วัตถุ

การตรวจ: กดกระจกตาแบบแอปพลาเนชันขณะตรวจสอบการสัมผัสระหว่างเลนส์กับกระจกตาด้วยกล้อง CCD ปรับโฟกัสด้วยมือ สังเกตตามลำดับจากชั้นผิวกระจกตา (0 ไมครอน) ไปยังชั้นลึก การจ้องตาคงที่สำคัญมาก ความร่วมมือของผู้รับการตรวจจำเป็น ระยะเวลาการตรวจประมาณ 5-15 นาที

ภาวะแทรกซ้อน: อาจเกิดการถลอกของเยื่อบุกระจกตา การติดเชื้อ (ความเสี่ยงสูงหากมีข้อบกพร่องของเยื่อบุอยู่ก่อน) ได้น้อยครั้ง

รายการ	HRT III-RCM	Confoscan 4
แหล่งกำเนิดแสง	เลเซอร์ไดโอด	แสงฮาโลเจน
ความละเอียดเชิงลึก	4 ไมครอน	25-27 ไมครอน
การสัมผัส	จำเป็น (TomoCap)	ไม่จำเป็นก็ได้

Q การตรวจ IVCM เจ็บหรือไม่?

A

เนื่องจากใช้ยาชาหยอดตา จึงแทบไม่มีความเจ็บปวดระหว่างการตรวจ มีเพียงความรู้สึกสัมผัสเบาๆ ของฝาครอบกับกระจกตา อาจมีอาการระคายเคืองชั่วคราวหลังการตรวจ แต่โดยทั่วไปจะหายไปอย่างรวดเร็ว

4. หลักการทางแสงและลักษณะเฉพาะของอุปกรณ์

หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคือ “การเป็นคอนโฟคอล” ⁷⁾ ทั้งระบบให้แสงและระบบตรวจจับมีรูเข็ม ทำให้สามารถตรวจจับเฉพาะแสงที่สะท้อนจากระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุได้อย่างเลือกสรร แสงกระเจิงจากภายนอกระนาบโฟกัสจะถูกกั้นโดยรูเข็ม ทำให้ได้คอนทราสต์สูงและความละเอียดเชิงลึกที่ดี

ในชนิดสแกนด้วยเลเซอร์ (HRT III-RCM) เลเซอร์ไดโอด 670 นาโนเมตรทำหน้าที่เป็นแหล่งกำเนิดแสงจุด สแกนกระจกตาทีละจุดเพื่อสร้างภาพ ความหนาของระนาบโฟกัส (ความหนาของภาพตัดขวางทางแสง) บางมากประมาณ 4 ไมโครเมตร ให้ภาพตัดขวางที่ชัดเจนในระดับเซลล์

ในชนิดสแกนด้วยช่องแสง (Confoscan 4) การสแกนทำด้วยลำแสงรูปช่อง ดังนั้นการเป็นคอนโฟคอลที่แท้จริงจะเกิดขึ้นเฉพาะในทิศทางตั้งฉากกับช่องแสงเท่านั้น ดังนั้นความละเอียดเชิงลึกคือ 25-27 ไมโครเมตร และความคมชัดของภาพด้อยกว่าชนิดสแกนด้วยเลเซอร์

ข้อจำกัดของ IVCM ได้แก่: ได้เฉพาะภาพระดับสีเทา (ไม่สามารถสังเกตสีได้), ไม่สามารถแยกแยะโครงสร้างภายในเซลล์, สังเกตได้ยากในกรณีกระจกตาขุ่นมัวรุนแรง, ยากต่อการระบุตำแหน่งที่สังเกตได้อย่างแม่นยำ, และขึ้นอยู่กับทักษะของผู้ตรวจ

5. การประยุกต์ใช้ทางคลินิกหลัก

การประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ IVCM มีหลากหลาย

การช่วยวินิจฉัยการติดเชื้อที่กระจกตา: มีประโยชน์เป็นส่วนเสริมของการตรวจเพาะเชื้อ สามารถตรวจพบเส้นใยของเชื้อราและซีสต์ของอะแคนทามีบา แต่การแปลผลต้องอาศัยความรู้เฉพาะทาง ⁸⁾ ในโรคเยื่อบุกระจกตาอักเสบจากเริม สามารถจับการเปลี่ยนแปลงของเส้นประสาทกระจกตาได้ ⁸⁾ ในโรคเยื่อบุผนังกระจกตาอักเสบจากไซโตเมกาโลไวรัส อาจพบ owl’s eye inclusion body

การแยกโรคกระจกตาเสื่อม: โรคกระจกตาเสื่อมแต่ละชนิดมีลักษณะเฉพาะที่พบได้จาก IVCM ทำให้สามารถแยกโรคแบบไม่รุกล้ำโดยการจดจำรูปแบบ ¹⁾ มีประโยชน์สูงในการคัดกรองก่อนการตรวจทางพันธุกรรมหรือการตัดชิ้นเนื้อ นอกจากนี้ยังสามารถประยุกต์ใช้ในการประเมินผลหลังการรักษา (PTK, DALK ฯลฯ) ¹⁾

การประเมินภาวะพร่องสเต็มเซลล์บริเวณลิมบัส (LSCD): การวินิจฉัยขึ้นอยู่กับการหายไปของโครงสร้างรั้ว Vogt, การแทนที่ของเยื่อบุกระจกตาด้วยเยื่อบุตาขาว, และการปรากฏของเซลล์กุณโฑ ⁶⁾ สามารถวัดความหนาแน่นของเซลล์เยื่อบุฐานเพื่อประเมินความรุนแรงของ LSCD ในเชิงปริมาณ ⁶⁾

การประเมินอาการบวมน้ำที่กระจกตาและโรคเยื่อบุผนังกระจกตา: IVCM สามารถสังเกตเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาได้แม้ผ่านกระจกตาที่บวมน้ำระดับปานกลาง จึงมีประโยชน์อย่างยิ่งในกรณีที่กล้องจุลทรรศน์สเปคคูลาร์ถ่ายภาพได้ยาก ⁷⁾ ในโรคกระจกตาเสื่อมฟุคส์ (FECD) นอกจากการประเมินเซลล์เยื่อบุผนังกระจกตาแล้ว ยังสามารถจับการลดลงของความหนาแน่นเส้นประสาทและการเปลี่ยนแปลงความหนาแน่นของเซลล์เดนไดรต์ ⁷⁾

การประเมินเส้นประสาทกระจกตา: การประเมินเชิงปริมาณของข่ายประสาทใต้ฐาน (subbasal nerve plexus) ใช้ในการวินิจฉัยโรคกระจกตาอักเสบจากเส้นประสาทเสื่อม (neurotrophic keratitis) และประเมินประสิทธิภาพการรักษา ³⁾ หลังการผ่าตัดฟื้นฟูเส้นประสาทกระจกตา (surgical corneal neurotization) การตรวจ IVCM จะพบสัญญาณของการสร้างเส้นประสาทใหม่ในช่วง 6 เดือนถึง 1 ปีหลังผ่าตัด ³⁾

การตรวจพบโรคภูมิต้านตนเองทั่วร่างกายในระยะเริ่มต้น: ในกลุ่มอาการโจเกรน (Sjögren’s syndrome) การลดลงของความหนาแน่นเส้นใยประสาทบริเวณกลางกระจกตาและการเพิ่มขึ้นของเซลล์เดนไดรต์ที่ถูกกระตุ้นสามารถตรวจพบได้ก่อนการแสดงอาการทางคลินิก ⁴⁾ หากพบเซลล์เดนไดรต์ที่ถูกกระตุ้นตั้งแต่ 2 เซลล์ขึ้นไปซึ่งมีส่วนยื่นตั้งแต่ 3 เส้นขึ้นไปบริเวณกลางกระจกตา มีรายงานความไว 60% และความจำเพาะ 77% สำหรับโรคภูมิคุ้มกันทั่วร่างกาย ⁴⁾

การประเมินหลังผ่าตัด: ใช้ในการติดตามการเปลี่ยนแปลงของขอบแผ่นปิดและเยื่อโบว์แมนหลังการทำ LASIK และ PRK รวมถึงการติดตามการสร้างเส้นประสาทใหม่ ²⁾ นอกจากนี้ยังใช้ในการตรวจหาการปฏิเสธการปลูกถ่ายกระจกตาในระยะเริ่มต้น

6. งานวิจัยล่าสุดและแนวโน้มในอนาคต

การวิเคราะห์ภาพอัตโนมัติ: ได้มีการพัฒนาระบบวัดปริมาณเส้นใยประสาทใต้ฐานอัตโนมัติ เช่น ซอฟต์แวร์ ACCMetrics ²⁾ ระบบจะคำนวณค่าพารามิเตอร์ต่างๆ เช่น ความหนาแน่นเส้นใยประสาท ความหนาแน่นของการแตกแขนง และความคดเคี้ยวอย่างเป็นกลาง ช่วยลดความแปรปรวนระหว่างผู้ตรวจ

การตรวจหาระยะก่อนแสดงอาการของโรค: ในผู้ป่วยกลุ่มอาการโจเกรน มีรายงานการตรวจพบความผิดปกติของ IVCM หลายปีก่อนที่แอนติบอดีจะเปลี่ยนเป็นบวกหรือมีอาการทางคลินิก ⁴⁾ สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า IVCM อาจเป็นเครื่องมือคัดกรองโรคภูมิต้านตนเอง

การจำแนกชนิดย่อยของโรคตาแห้ง: โดยการวิเคราะห์รูปร่างและรูปแบบการกระจายของเซลล์เดนไดรต์ อาจสามารถแยกความแตกต่างระหว่างตาแห้งที่เกิดจากภูมิคุ้มกันและตาแห้งชนิดระเหยเพิ่มขึ้น ⁴⁾

การติดตามการสร้างเส้นประสาทใหม่หลังผ่าตัด: กำลังมีการวิจัยเพื่อติดตามกระบวนการสร้างเส้นประสาทใหม่หลังการผ่าตัดฟื้นฟูเส้นประสาทกระจกตาหรือการเชื่อมขวางกระจกตาโดยใช้ IVCM ตามช่วงเวลา ³⁾ ในอนาคต คาดว่าจะถูกใช้เป็นจุดสิ้นสุดเชิงวัตถุประสงค์สำหรับการประเมินประสิทธิภาพการรักษา

การบูรณาการปัญญาประดิษฐ์: กำลังมีการพัฒนาระบบจำแนกและวินิจฉัยภาพ IVCM อัตโนมัติโดยใช้การเรียนรู้เชิงลึก ซึ่งคาดว่าจะนำไปประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยการติดเชื้ออย่างรวดเร็วและการแยกแยะโรคกระจกตาเสื่อมโดยอัตโนมัติ

ข้อจำกัดความรับผิดชอบเกี่ยวกับข้อมูลทางการแพทย์

เนื้อหาในบทความนี้ไม่สามารถใช้แทนการวินิจฉัยหรือการรักษาจากผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์ หากคุณมีความผิดปกติทางตา ควรปรึกษาจักษุแพทย์

7. เอกสารอ้างอิง

1. Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.

2. Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.

3. Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.

4. Mercado C, Muñoz-Ortiz J, Godin F, Galor A. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocular immunology and inflammation. 2023;31(9):1741-1745. doi:10.1080/09273948.2022.2103713. PMID:35914299; PMCID:PMC9889574.

5. Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the Management of Infectious Keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.

6. Deng SX, Borderie V, Chan CC, Dana R, Figueiredo FC, Gomes JAP, Pellegrini G, Shimmura S, et al. Global Consensus on Definition, Classification, Diagnosis, and Staging of Limbal Stem Cell Deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375. doi:10.1097/ICO.0000000000001820. PMID:30614902; PMCID:PMC6363877.

7. Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.

8. 日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第3版作成委員会. 感染性角膜炎診療ガイドライン(第3版). 日眼会誌. 2023;127(10):859-895.