Конфокальный микроскоп (прижизненный конфокальный микроскоп роговицы)

Ключевые моменты с первого взгляда

Конфокальная микроскопия роговицы in vivo (IVCM) — это метод диагностической визуализации, позволяющий неинвазивно наблюдать роговицу на клеточном уровне.
Обеспечивая латеральное разрешение 1–2 мкм и разрешение по глубине 4 мкм, этот метод также называют «биопсией in vivo».
Клинические применения широки, включая выявление гифов грибов при грибковом кератите, обнаружение акантамебы и дифференциальную диагностику дистрофий роговицы⁵⁾⁸⁾.
Даже в случаях отека роговицы, когда зеркальная микроскопия затруднена, возможна оценка эндотелиальных клеток⁷⁾.
Количественная оценка суббазального нервного сплетения также используется для раннего выявления нарушений чувствительности роговицы и системных аутоиммунных заболеваний⁴⁾.

1. Что такое конфокальная микроскопия?

Конфокальная микроскопия — это высокоразрешающий микроскоп, основанный на оптическом принципе, согласно которому осветительный и наблюдательный свет имеют одну и ту же фокальную плоскость. В офтальмологии он применяется для наблюдения роговицы in vivo, а также используется для оценки эндотелиальной дистрофии Фукса⁷⁾.

Основные аппараты, используемые в настоящее время в клинической практике, относятся к двум следующим системам.

Лазерный сканирующий тип (HRT III-RCM) : Производство Heidelberg Engineering. Использует диодный лазер 670 нм в качестве источника света, объектив 63x, поле обзора 400×400 мкм. Обладает высоким латеральным разрешением 1–2 мкм и разрешением по глубине около 4 мкм¹⁾²⁾. Используется в контакте с роговицей через одноразовый колпачок из ПММА (TomoCap) и офтальмологический гель.

Щелевой сканирующий тип (Confoscan 4) : Производство Nidek. Использует галогеновый источник света, может использоваться бесконтактно. Оснащен функцией автоматического сканирования и относительно прост в управлении, но разрешение по глубине составляет всего 25–27 мкм. В настоящее время производство прекращено.

IVCM имеет три режима визуализации. Секционное сканирование получает неподвижное изображение на одной глубине. Объемное сканирование получает 30–40 последовательных срезов с интервалом 2 мкм. Последовательное сканирование получает до 100 кадров видео на одной глубине, что подходит для наблюдения динамических изменений.

Q Является ли конфокальная микроскопия исследованием, доступным в любом учреждении?

IVCM требует специального оборудования и опытного оператора, поэтому она внедрена в основном в университетских больницах и специализированных офтальмологических клиниках. Это исследование доступно не во всех офтальмологических кабинетах, но оно особенно полезно для диагностики инфекций роговицы и дистрофий роговицы, и при необходимости пациенты направляются.

2. Основные находки и клиническое значение

Суббазальное нервное сплетение нормальной роговицы

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

Тонкие гиперрефлективные волокна проходят параллельно, и нормальное расположение суббазального нервного сплетения сохраняется. Это эталонное изображение, показывающее ход и плотность нервных волокон.

Результаты нормальной роговицы

При IVCM можно наблюдать каждый слой роговицы по отдельности.

Эпителий роговицы: Поверхностные клетки многоугольные, размером 40–50 мкм. Крыловидные клетки имеют размер 20–30 мкм с яркими клеточными границами, около 5000 клеток/мм². Базальные клетки имеют размер 8–10 мкм, темную цитоплазму и яркие границы (десмосомы), образуя сетчатый рисунок. Плотность базальных клеток составляет 3600–8996 клеток/мм².

Мембрана Боумена: Наблюдается как бесструктурный серовато-белый слой толщиной около 10 мкм. Через нее проходят нервные пучки.

Строма роговицы: Кератоциты в неактивном состоянии выглядят темными, а в активированном — светлыми амебовидными. В передней строме плотность клеток выше.

Десцеметова мембрана: Определяется как туманный слой толщиной 6–10 мкм. Клеточные структуры обычно не различимы.

Эндотелий роговицы: Шестиугольные клетки расположены мозаично. Диаметр клеток около 20 мкм, плотность 2550–2720 клеток/мм², с возрастом уменьшается примерно на 0,6% в год.

Суббазальное нервное сплетение: Наблюдается как четкообразные изогнутые структуры непосредственно под мембраной Боумена³⁾. Оно образует завихренный рисунок (whorl pattern) примерно на 1–2 мм книзу и кнутри от центра роговицы. Диаметр волокон составляет 0,52–4,6 мкм.

Дендритные клетки (клетки Лангерганса): Распределены в центре роговицы 34 ± 3 клеток/мм², на периферии 98 ± 8 клеток/мм². Являются индикатором иммунного ответа.

Патологические результаты

Инфекции роговицы: При грибковом кератите в строме четко видны нитевидные гифы⁸⁾. Акантамебы обнаруживаются в виде цист (сферические с двойной стенкой), но их дифференциация от воспалительных клеток требует опыта⁸⁾. Бактерии трудно визуализировать напрямую из-за их малого размера⁵⁾.

Дистрофии роговицы: При дистрофии роговицы Авеллино (GCD2) наблюдаются гиперрефлективные гранулярные отложения в базальном эпителиальном слое и неправильные гиперрефлективные скопления в поверхностной и средней строме¹⁾. Решетчатая дистрофия роговицы I типа характеризуется сетчатыми отложениями и разветвленными волокнами¹⁾. При пятнистой дистрофии роговицы наблюдаются отложения с нечеткими границами, а при кристаллической дистрофии Шнидера — игольчатые кристаллы¹⁾.

Эктазии роговицы: При кератоконусе наблюдается снижение плотности кератоцитов, коррелирующее с тяжестью. Также отмечаются разрывы мембраны Боумена. Эктазия роговицы после PRK характеризуется отсутствием мембраны Боумена и уменьшением количества передних кератоцитов, что отличается от IVCM-паттерна кератоконуса²⁾.

3. Методика и техника исследования

Процедура исследования IVCM следующая.

Предварительная подготовка : Закапывание анестетика (например, оксибупрокаина). Нанести офтальмологический гель на одноразовый TomoCap (из ПММА) и закрепить его на конце объектива.

Проведение исследования : Аппланировать роговицу, контролируя контакт линзы с роговицей с помощью CCD-камеры. Вручную настроить фокус и последовательно наблюдать от поверхностного слоя (0 мкм) до глубоких слоев. Фиксация взгляда очень важна, сотрудничество пациента необходимо. Время исследования составляет около 5–15 минут.

Осложнения : Редко могут возникнуть ссадина эпителия роговицы или инфекция (высокий риск при наличии предшествующего дефекта эпителия).

Параметр	HRT III-RCM	Confoscan 4
Источник света	Диодный лазер	Галогенный свет
Глубинное разрешение	4 мкм	25–27 мкм
Контакт	Требуется (TomoCap)	Необязательно

Q Болезненна ли процедура IVCM?

Благодаря анестезирующим каплям боль во время исследования практически отсутствует. Ощущается лишь легкое прикосновение колпачка к роговице. После исследования может возникнуть временное ощущение инородного тела, которое обычно быстро проходит.

4. Оптические принципы и особенности прибора

Основной принцип конфокального микроскопа — «конфокальность» ⁷⁾. Как осветительная, так и детектирующая системы имеют точечную апертуру, избирательно детектируя только свет, отраженный от фокальной плоскости объектива. Рассеянный свет извне фокальной плоскости блокируется точечной апертурой, что обеспечивает высокий контраст и глубину разрешения.

В лазерном сканирующем типе (HRT III-RCM) диодный лазер 670 нм служит точечным источником света, сканируя роговицу точка за точкой для построения изображения. Толщина фокальной плоскости (толщина оптического среза) составляет около 4 мкм, что очень тонко и обеспечивает четкие поперечные изображения на клеточном уровне.

В щелевом сканирующем типе (Confoscan 4) сканирование осуществляется щелевым световым лучом, поэтому истинная конфокальность достигается только в направлении, перпендикулярном щели. Следовательно, глубина разрешения составляет 25–27 мкм, а резкость изображения ниже, чем у лазерного сканирующего типа.

Ограничения IVCM включают: только полутоновые изображения (цветное наблюдение невозможно), невозможность разрешения внутриклеточных структур, трудности наблюдения при сильном помутнении роговицы, трудности точной локализации места наблюдения и зависимость от навыков оператора.

5. Основные клинические применения

Клинические применения IVCM разнообразны.

Вспомогательная диагностика инфекций роговицы: Полезна в дополнение к культуральному исследованию. Можно обнаружить грибковые гифы и цисты акантамебы, но интерпретация результатов требует специальных знаний ⁸⁾. При герпетическом кератите можно выявить изменения нервов роговицы ⁸⁾. При цитомегаловирусном эндотелите роговицы могут наблюдаться включения типа «совиный глаз».

Дифференциальная диагностика дистрофий роговицы: Каждая дистрофия имеет характерные признаки IVCM, что позволяет проводить неинвазивную дифференциацию по паттерну ¹⁾. Высокая полезность в качестве скрининга перед генетическим тестированием или биопсией. Также может применяться для оценки эффекта лечения (PTK, DALK и др.) ¹⁾.

Оценка недостаточности лимбальных стволовых клеток (LSCD): Исчезновение палисадов Фогта, замещение роговичного эпителия конъюнктивальным эпителием и появление бокаловидных клеток являются диагностическими критериями ⁶⁾. Измерение плотности базальных эпителиальных клеток позволяет количественно оценить тяжесть LSCD ⁶⁾.

Оценка отека роговицы и заболеваний эндотелия: IVCM позволяет наблюдать эндотелиальные клетки даже через умеренный отек роговицы, что особенно полезно в случаях, когда зеркальная микроскопия затруднена ⁷⁾. При эндотелиальной дистрофии Фукса (FECD) помимо оценки эндотелиальных клеток можно выявить снижение плотности нервов и изменения плотности дендритных клеток ⁷⁾.

Оценка роговичных нервов: Количественная оценка суббазального нервного сплетения используется для диагностики нейротрофической кератопатии и оценки эффективности лечения³⁾. После хирургической нейротизации роговицы с помощью IVCM признаки регенерации наблюдаются через 6 месяцев – 1 год после операции³⁾.

Раннее выявление системных аутоиммунных заболеваний: При синдроме Шегрена снижение плотности нервных волокон в центре роговицы и увеличение количества активированных дендритных клеток могут быть обнаружены до клинической манифестации⁴⁾. Наличие не менее 2 активированных дендритных клеток с 3 или более отростками в центральной роговице имеет чувствительность 60% и специфичность 77% для системных аутоиммунных заболеваний⁴⁾.

Послеоперационная оценка: Используется для наблюдения за изменениями края лоскута, мембраны Боумена и регенерацией нервов после LASIK и PRK²⁾. Также применяется для раннего выявления отторжения после трансплантации роговицы.

6. Последние исследования и перспективы

Автоматический анализ изображений: Разработаны системы автоматической количественной оценки суббазальных нервных волокон, такие как программное обеспечение ACCMetrics²⁾. Они объективно рассчитывают такие параметры, как плотность нервных волокон, плотность ветвления и извитость, уменьшая вариабельность между исследователями.

Выявление доклинической стадии заболеваний: При синдроме Шегрена сообщалось об обнаружении аномалий на IVCM за несколько лет до сероконверсии или появления клинических симптомов⁴⁾. Это предполагает, что IVCM может стать скрининговым инструментом для аутоиммунных заболеваний.

Классификация подтипов синдрома сухого глаза: Анализ морфологии и распределения дендритных клеток может позволить дифференцировать иммуноопосредованный сухой глаз и сухой глаз испарительного типа⁴⁾.

Мониторинг послеоперационной регенерации нервов: Проводятся исследования по отслеживанию процесса регенерации нервов после нейротизации роговицы или кросслинкинга роговицы с помощью IVCM³⁾. В будущем ожидается использование в качестве объективной конечной точки эффективности лечения.

Интеграция искусственного интеллекта: Разрабатываются системы автоматической классификации и диагностики изображений IVCM с использованием глубокого обучения, с ожидаемым применением для быстрой диагностики инфекций и автоматической дифференциации дистрофий роговицы.

7. Ссылки

Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.
Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.
Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.
Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.
Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.
Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.
Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.
日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.