Mikroskop Konfokal (Mikroskop Konfokal Kornea In Vivo)

Poin-poin penting sekilas

1. Apa itu mikroskop konfokal?

Mikroskop konfokal adalah mikroskop resolusi tinggi yang didasarkan pada prinsip optik di mana cahaya iluminasi dan cahaya observasi berbagi bidang fokus yang sama. Dalam oftalmologi, ini diterapkan untuk pengamatan kornea in vivo, dan juga digunakan untuk evaluasi distrofi endotel Fuchs ⁷⁾.

Perangkat utama yang saat ini digunakan dalam praktik klinis adalah dua jenis berikut:

Tipe pemindai laser (HRT III-RCM): Diproduksi oleh Heidelberg Engineering. Menggunakan laser dioda 670 nm sebagai sumber cahaya, lensa objektif 63x, dan bidang pandang 400 × 400 μm. Memiliki resolusi lateral 1-2 μm dan resolusi kedalaman sekitar 4 μm ¹⁾²⁾. Digunakan dengan penutup sekali pakai PMMA (TomoCap) dan gel oftalmik, dikontakkan dengan kornea.

Tipe pemindai celah (Confoscan 4): Diproduksi oleh Nidek. Menggunakan sumber cahaya halogen, dan dapat digunakan tanpa kontak. Dilengkapi dengan fungsi pemindaian otomatis sehingga relatif mudah dioperasikan, tetapi resolusi kedalaman hanya 25-27 μm. Saat ini produksinya dihentikan.

IVCM memiliki tiga mode pencitraan. Pemindaian bagian mengambil gambar diam pada satu kedalaman. Pemindaian volume mengambil 30-40 bagian berurutan dengan interval 2 μm. Pemindaian sekuens mengambil hingga 100 frame video pada kedalaman yang sama, cocok untuk mengamati perubahan dinamis.

Q Apakah pemeriksaan mikroskop konfokal dapat dilakukan di fasilitas mana pun?

IVCM memerlukan peralatan khusus dan pemeriksa yang terampil, sehingga terutama dipasang di rumah sakit universitas dan pusat oftalmologi spesialis. Tidak tersedia di semua klinik mata, tetapi sangat berguna untuk diagnosis infeksi kornea dan distrofi kornea, dan pasien dirujuk sesuai kebutuhan.

2. Temuan utama dan signifikansi klinis

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

Serat tipis reflektif tinggi berjalan paralel, mempertahankan susunan normal pleksus saraf subbasal. Ini adalah gambar referensi untuk jalur dan kepadatan serat saraf.

Temuan Kornea Normal

IVCM memungkinkan pengamatan setiap lapisan kornea secara individual.

Epitel Kornea: Sel superfisial berbentuk poligonal, berukuran 40–50 μm. Sel wing berukuran 20–30 μm dengan batas sel yang jelas, sekitar 5.000 sel/mm². Sel basal berukuran 8–10 μm dengan sitoplasma gelap dan batas terang (desmosom), menunjukkan pola seperti sarang lebah. Kepadatan sel basal adalah 3.600–8.996 sel/mm².

Membran Bowman: Diamati sebagai lapisan abu-abu tanpa struktur setebal sekitar 10 μm. Berkas saraf berjalan di dalamnya.

Stroma Kornea: Sel stroma kornea (keratosit) tampak gelap saat tidak aktif, dan terang seperti amuba saat aktif. Kepadatan sel lebih tinggi di stroma anterior.

Membran Descemet: Diamati sebagai lapisan berkabut setebal 6–10 μm. Struktur sel biasanya tidak dapat diidentifikasi.

Endotel Kornea: Sel heksagonal tersusun seperti mozaik. Diameter sel sekitar 20 μm, kepadatan 2.550–2.720 sel/mm², menurun sekitar 0,6% per tahun seiring bertambahnya usia.

Pleksus Saraf Subbasal: Diamati sebagai struktur melengkung seperti manik-manik yang berjalan tepat di bawah membran Bowman ³⁾. Membentuk pola pusaran (whorl pattern) sekitar 1–2 mm inferior nasal dari pusat kornea. Diameter serat 0,52–4,6 μm.

Sel Dendritik (Sel Langerhans): Terdistribusi 34 ± 3 sel/mm² di pusat kornea dan 98 ± 8 sel/mm² di perifer. Merupakan indikator respons imun.

Temuan Abnormal

Infeksi Kornea: Pada keratitis jamur, hifa filamen terlihat jelas di stroma ⁸⁾. Acanthamoeba terdeteksi sebagai kista (bulat dengan dinding ganda), tetapi memerlukan pengalaman untuk membedakannya dari sel inflamasi ⁸⁾. Bakteri sulit divisualisasikan secara langsung karena ukuran selnya terlalu kecil ⁵⁾.

Distrofi Kornea: Pada distrofi kornea Avellino (GCD2), terdapat deposit granular hiperreflektif di lapisan basal epitel, dan gumpalan hiperreflektif tidak teratur di stroma superfisial hingga tengah ¹⁾. Distrofi kornea lattice tipe I ditandai dengan deposit seperti jaring dan serat bercabang ¹⁾. Distrofi kornea makula menunjukkan deposit dengan batas tidak jelas, dan distrofi kornea kristal Schnyder menunjukkan kristal seperti jarum ¹⁾.

Ektasia Kornea: Pada keratokonus, terjadi penurunan kepadatan keratosit yang berkorelasi dengan keparahan. Juga ditemukan robekan membran Bowman. Pada ektasia kornea pasca-PRK, ditandai dengan defek membran Bowman dan penurunan keratosit anterior, menunjukkan pola IVCM yang berbeda dari keratokonus ²⁾.

3. Teknik dan Metode Pemeriksaan

Prosedur pemeriksaan IVCM adalah sebagai berikut:

Persiapan: Berikan anestesi tetes mata (misalnya oksibuprokain). Oleskan gel mata pada TomoCap sekali pakai (terbuat dari PMMA) dan pasang pada ujung lensa objektif.

Pelaksanaan pemeriksaan: Lakukan aplanation kornea sambil memantau kontak lensa-kornea dengan kamera CCD. Atur fokus secara manual, amati secara berurutan dari lapisan superfisial kornea (0 μm) ke lapisan dalam. Fiksasi sangat penting, kerja sama pasien sangat diperlukan. Waktu pemeriksaan sekitar 5-15 menit.

Komplikasi: Jarang terjadi abrasi epitel kornea, infeksi (risiko tinggi jika ada defek epitel yang sudah ada sebelumnya).

Item	HRT III-RCM	Confoscan 4
Sumber cahaya	Laser dioda	Lampu halogen
Resolusi kedalaman	4 μm	25-27 μm
Kontak	Perlu (TomoCap)	Tidak perlu juga

Q Apakah pemeriksaan IVCM terasa sakit?

Karena menggunakan anestesi tetes mata, hampir tidak ada rasa sakit selama pemeriksaan. Hanya ada sensasi sentuhan ringan dari kap pada kornea. Mungkin timbul sensasi benda asing sementara setelah pemeriksaan, tetapi biasanya cepat hilang.

4. Prinsip Optik dan Karakteristik Perangkat

Prinsip dasar mikroskop confocal adalah “confocality” ⁷⁾. Baik sistem iluminasi maupun sistem deteksi memiliki lubang jarum, sehingga hanya cahaya yang dipantulkan dari bidang fokus lensa objektif yang dideteksi secara selektif. Cahaya hamburan dari luar bidang fokus dihalangi oleh lubang jarum, sehingga diperoleh kontras tinggi dan resolusi kedalaman yang baik.

Pada tipe pemindaian laser (HRT III-RCM), laser dioda 670 nm berfungsi sebagai sumber cahaya titik, memindai kornea titik demi titik untuk membangun gambar. Ketebalan bidang fokus (ketebalan irisan optik) sangat tipis, sekitar 4 μm, memberikan gambar penampang yang jelas pada tingkat sel.

Pada tipe pemindaian celah (Confoscan 4), pemindaian dilakukan dengan berkas cahaya berbentuk celah, sehingga confocality sejati hanya diperoleh pada arah tegak lurus celah. Oleh karena itu, resolusi kedalaman adalah 25-27 μm, dan ketajaman gambar lebih rendah dibandingkan tipe pemindaian laser.

Keterbatasan IVCM meliputi: hanya gambar skala abu-abu (tidak dapat mengamati warna), tidak dapat menguraikan struktur intraseluler, kesulitan pengamatan pada kasus kekeruhan kornea berat, kesulitan dalam menentukan lokasi pengamatan secara tepat, dan ketergantungan pada keterampilan pemeriksa.

5. Aplikasi Klinis Utama

Aplikasi klinis IVCM sangat beragam.

Bantuan Diagnosis Infeksi Kornea: Berguna sebagai pelengkap pemeriksaan kultur. Dapat mendeteksi hifa jamur dan kista Acanthamoeba, tetapi interpretasi temuan memerlukan pengetahuan khusus ⁸⁾. Pada keratitis herpes, perubahan saraf kornea dapat ditangkap ⁸⁾. Pada endotelitis kornea akibat sitomegalovirus, kadang ditemukan inklusi mata burung hantu.

Diferensiasi Distrofi Kornea: Setiap distrofi memiliki temuan IVCM yang khas, memungkinkan diferensiasi non-invasif berdasarkan pengenalan pola ¹⁾. Sangat berguna sebagai skrining awal sebelum tes genetik atau biopsi. Juga dapat diterapkan untuk evaluasi efek setelah perawatan (PTK, DALK, dll.) ¹⁾.

Evaluasi Defisiensi Sel Punca Limbus (LSCD): Diagnosis didasarkan pada hilangnya struktur pagar Vogt, penggantian epitel kornea oleh epitel konjungtiva, dan munculnya sel goblet ⁶⁾. Kepadatan sel epitel basal dapat diukur untuk menilai keparahan LSCD secara kuantitatif ⁶⁾.

Evaluasi Edema Kornea dan Penyakit Endotel: IVCM dapat mengamati sel endotel bahkan melalui edema kornea sedang, sehingga sangat berguna pada kasus di mana mikroskop spekuler sulit dilakukan ⁷⁾. Pada Distrofi Endotel Kornea Fuchs (FECD), selain evaluasi sel endotel, juga dapat ditangkap penurunan kepadatan saraf dan perubahan kepadatan sel dendritik ⁷⁾.

Penilaian saraf kornea: Penilaian kuantitatif pleksus saraf subbasal digunakan untuk diagnosis keratitis neurotropik dan evaluasi efektivitas pengobatan ³⁾. Setelah operasi neurotisasi kornea (surgical corneal neurotization), IVCM menunjukkan tanda-tanda regenerasi saraf pada 6 bulan hingga 1 tahun pasca operasi ³⁾.

Deteksi dini penyakit autoimun sistemik: Pada sindrom Sjögren, penurunan kepadatan serabut saraf di kornea sentral dan peningkatan sel dendritik aktif dapat terdeteksi sebelum timbulnya gejala klinis ⁴⁾. Jika terdapat dua atau lebih sel dendritik aktif dengan tiga atau lebih prosesus di kornea sentral, dilaporkan sensitivitas 60% dan spesifisitas 77% untuk penyakit imun sistemik ⁴⁾.

Evaluasi pasca operasi: Digunakan untuk memantau perubahan tepi flap dan membran Bowman setelah LASIK dan PRK, serta follow-up regenerasi saraf ²⁾. Juga diterapkan untuk deteksi dini reaksi penolakan setelah transplantasi kornea.

6. Penelitian terbaru dan prospek masa depan

Analisis gambar otomatis: Sistem kuantitatif otomatis untuk serabut saraf subbasal telah dikembangkan, seperti perangkat lunak ACCMetrics ²⁾. Parameter seperti kepadatan serabut saraf, kepadatan percabangan, dan tortuositas dihitung secara objektif, mengurangi variabilitas antar pemeriksa.

Deteksi tahap praklinis penyakit: Pada kasus sindrom Sjögren, telah dilaporkan deteksi kelainan IVCM beberapa tahun sebelum serokonversi antibodi atau munculnya gejala klinis ⁴⁾. Hal ini menunjukkan potensi IVCM sebagai alat skrining untuk penyakit autoimun.

Klasifikasi subtipe mata kering: Dengan menganalisis morfologi dan pola distribusi sel dendritik, dimungkinkan untuk membedakan antara mata kering imun-mediated dan mata kering evaporatif ⁴⁾.

Pemantauan regenerasi saraf pasca operasi: Penelitian sedang berlangsung untuk melacak proses regenerasi saraf setelah neurotisasi kornea atau cross-linking kornea menggunakan IVCM secara serial ³⁾. Di masa depan, diharapkan dapat digunakan sebagai titik akhir objektif untuk evaluasi efektivitas terapi.

Integrasi kecerdasan buatan: Sistem klasifikasi dan diagnosis otomatis gambar IVCM menggunakan deep learning sedang dikembangkan, yang diharapkan dapat diterapkan untuk diagnosis cepat infeksi dan diferensiasi otomatis distrofi kornea.

7. Referensi

Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.
Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.
Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.
Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.
Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.
Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.
Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.
日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.