कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (जीवित कॉर्निया कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप)

एक नज़र में महत्वपूर्ण बिंदु

इस परीक्षण के मुख्य बिंदु

• इन विवो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (IVCM) एक इमेजिंग डायग्नोस्टिक विधि है जो कॉर्निया को कोशिकीय स्तर पर गैर-आक्रामक रूप से देखती है।
• पार्श्व रिज़ॉल्यूशन 1-2 μm और गहराई रिज़ॉल्यूशन 4 μm प्राप्त करता है, और इसे ‘इन विवो बायोप्सी’ भी कहा जाता है।
• फंगल केराटाइटिस में फंगल हाइफे का पता लगाना, अकैंथअमीबा का पता लगाना, और कॉर्नियल डिस्ट्रोफी का विभेदक निदान जैसे नैदानिक अनुप्रयोग व्यापक हैं⁵⁾⁸⁾।
• स्पेक्युलर माइक्रोस्कोपी से देखने में कठिन कॉर्नियल एडिमा के मामलों में भी एंडोथेलियल कोशिकाओं का मूल्यांकन संभव है⁷⁾।
• सबबेसल नर्व प्लेक्सस के मात्रात्मक मूल्यांकन का उपयोग कॉर्नियल संवेदना विकारों और प्रणालीगत ऑटोइम्यून रोगों के शीघ्र पता लगाने के लिए भी किया जा रहा है⁴⁾।

1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी क्या है?

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप है जो ऑप्टिकल सिद्धांत पर आधारित है कि प्रकाश और अवलोकन प्रकाश एक ही फोकल प्लेन साझा करते हैं। नेत्र विज्ञान में, इसका उपयोग कॉर्निया के इन विवो अवलोकन के लिए किया जाता है, और फुच्स एंडोथेलियल कॉर्नियल डिस्ट्रोफी के मूल्यांकन में भी किया जाता है⁷⁾।

वर्तमान में नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने वाले मुख्य उपकरण निम्नलिखित दो प्रकार के हैं।

लेज़र स्कैनिंग प्रकार (HRT III-RCM) : Heidelberg Engineering द्वारा निर्मित। 670 nm डायोड लेज़र को प्रकाश स्रोत के रूप में उपयोग करता है, ऑब्जेक्टिव लेंस 63x, देखने का क्षेत्र 400×400 μm। पार्श्व रिज़ॉल्यूशन 1-2 μm, गहराई रिज़ॉल्यूशन लगभग 4 μm है¹⁾²⁾। PMMA डिस्पोजेबल कैप (TomoCap) और नेत्र जेल के माध्यम से कॉर्निया के संपर्क में उपयोग किया जाता है।

स्लिट स्कैन प्रकार (Confoscan 4) : Nidek द्वारा निर्मित। हैलोजन प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है, और गैर-संपर्क में भी उपयोग किया जा सकता है। स्वचालित स्कैन फ़ंक्शन से सुसज्जित, संचालन अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन गहराई रिज़ॉल्यूशन केवल 25-27 μm तक सीमित है। वर्तमान में इसका उत्पादन बंद हो चुका है।

IVCM में तीन इमेजिंग मोड हैं। सेक्शन स्कैन एकल गहराई पर स्थिर छवि प्राप्त करता है। वॉल्यूम स्कैन 2 μm अंतराल पर 30-40 सतत अनुभाग प्राप्त करता है। सीक्वेंस स्कैन समान गहराई पर अधिकतम 100 फ्रेम की वीडियो प्राप्त करता है, जो गतिशील परिवर्तनों के अवलोकन के लिए उपयुक्त है।

Q क्या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी हर सुविधा में उपलब्ध जांच है?

A

IVCM के लिए विशेष उपकरण और अनुभवी ऑपरेटर की आवश्यकता होती है, इसलिए यह मुख्य रूप से विश्वविद्यालय अस्पतालों और विशेष नेत्र क्लीनिकों में उपलब्ध है। यह हर नेत्र चिकित्सालय में उपलब्ध जांच नहीं है, लेकिन कॉर्नियल संक्रमण और कॉर्नियल डिस्ट्रोफी के निदान में विशेष रूप से उपयोगी है, और आवश्यकता होने पर रेफर किया जाता है।

2. मुख्य निष्कर्ष और नैदानिक महत्व

सामान्य कॉर्निया का सबबेसल नर्व प्लेक्सस

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

पतली उच्च-परावर्तन रेशे समानांतर चलते हैं, और सामान्य सबबेसल तंत्रिका जाल का क्रम बना रहता है। यह तंत्रिका तंतुओं के मार्ग और घनत्व को दर्शाने वाली एक संदर्भ छवि है।

सामान्य कॉर्निया के निष्कर्ष

IVCM में कॉर्निया की प्रत्येक परत को अलग-अलग देखा जा सकता है।

कॉर्नियल एपिथेलियम: सतही कोशिकाएं बहुभुजाकार और 40-50 μm होती हैं। पंख कोशिकाएं 20-30 μm होती हैं जिनमें चमकीली कोशिका सीमाएं होती हैं, लगभग 5,000 कोशिकाएं/mm²। बेसल कोशिकाएं 8-10 μm होती हैं जिनमें गहरा कोशिकाद्रव्य और चमकीली सीमाएं (डेसमोसोम) होती हैं, और मधुकोश पैटर्न प्रस्तुत करती हैं। बेसल कोशिका घनत्व 3,600-8,996 कोशिकाएं/mm² है।

बोमैन झिल्ली: लगभग 10 μm मोटी एक संरचनाहीन भूरी-सफेद परत के रूप में देखी जाती है। इसमें तंत्रिका बंडल चलते हैं।

कॉर्नियल स्ट्रोमा: कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाएं (केराटोसाइट्स) निष्क्रिय अवस्था में गहरी और सक्रिय अवस्था में चमकीली अमीबा जैसी दिखती हैं। पूर्वकाल स्ट्रोमा में कोशिका घनत्व अधिक होता है।

डेसीमेट झिल्ली: 6-10 μm मोटी एक धुंधली परत के रूप में पहचानी जाती है। कोशिकीय संरचनाएं सामान्यतः पहचानी नहीं जा सकतीं।

कॉर्नियल एंडोथेलियम: षट्कोणीय कोशिकाएं मोज़ेक पैटर्न में व्यवस्थित होती हैं। कोशिका व्यास लगभग 20 μm, घनत्व 2,550-2,720 कोशिकाएं/mm², जो उम्र के साथ प्रति वर्ष लगभग 0.6% घटता है।

सबबेसल तंत्रिका जाल: बोमैन झिल्ली के ठीक नीचे मनके जैसी घुमावदार संरचनाओं के रूप में देखा जाता है³⁾। कॉर्निया के केंद्र से लगभग 1-2 मिमी नीचे और अंदर की ओर एक भंवर पैटर्न (whorl pattern) बनाता है। तंतु व्यास 0.52-4.6 μm है।

डेंड्रिटिक कोशिकाएं (लैंगरहैंस कोशिकाएं): कॉर्निया के केंद्र में 34 ± 3 कोशिकाएं/mm² और परिधि में 98 ± 8 कोशिकाएं/mm² पर वितरित होती हैं। ये प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का संकेतक हैं।

असामान्य निष्कर्ष

कॉर्नियल संक्रमण: फंगल केराटाइटिस में स्ट्रोमा के अंदर फिलामेंटस हाइफे स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं⁸⁾। अकैंथअमीबा सिस्ट (दोहरी दीवार वाली गोलाकार संरचना) के रूप में पाए जाते हैं, लेकिन सूजन कोशिकाओं से अंतर करने के लिए अनुभव की आवश्यकता होती है⁸⁾। बैक्टीरिया को सीधे देखना मुश्किल है क्योंकि व्यक्तिगत जीवाणु बहुत छोटे होते हैं⁵⁾।

कॉर्नियल डिस्ट्रोफी: एवेलिनो कॉर्नियल डिस्ट्रोफी (GCD2) में बेसल एपिथेलियल परत में उच्च-चमक दानेदार जमाव और सतही से मध्य स्ट्रोमा में अनियमित उच्च-चमक क्लस्टर देखे जाते हैं¹⁾। लैटिस कॉर्नियल डिस्ट्रोफी टाइप I में जालीदार जमाव और शाखित तंतु विशेषता हैं¹⁾। मैक्यूलर कॉर्नियल डिस्ट्रोफी में अस्पष्ट सीमाओं वाला जमाव देखा जाता है, और श्नाइडर क्रिस्टलीय कॉर्नियल डिस्ट्रोफी में सुई के आकार के क्रिस्टल देखे जाते हैं¹⁾।

कॉर्नियल एक्टेसिया: केराटोकोनस में केराटोसाइट घनत्व में कमी देखी जाती है, जो गंभीरता से संबंधित है। बोमैन झिल्ली में दरारें भी देखी जाती हैं। PRK के बाद कॉर्नियल एक्टेसिया में बोमैन झिल्ली की अनुपस्थिति और पूर्वकाल केराटोसाइट्स में कमी विशेषता है, जो केराटोकोनस से भिन्न IVCM पैटर्न दिखाता है²⁾।

3. जांच तकनीक और विधि

IVCM जांच प्रक्रिया निम्नलिखित है।

पूर्व-उपचार : आंखों में एनेस्थेटिक ड्रॉप (जैसे ऑक्सीबुप्रोकेन) डालें। डिस्पोजेबल TomoCap (PMMA से बना) पर नेत्र संबंधी जेल लगाएं और इसे ऑब्जेक्टिव लेंस के सिरे पर लगाएं।

जांच का संचालन : CCD कैमरे से लेंस-कॉर्निया संपर्क की निगरानी करते हुए कॉर्निया को समतल करें। मैन्युअल रूप से फोकस समायोजित करें और कॉर्निया की सतही परत (0 μm) से गहरी परतों तक क्रमिक रूप से देखें। स्थिर दृष्टि (फिक्सेशन) बहुत महत्वपूर्ण है, रोगी का सहयोग आवश्यक है। जांच में लगभग 5–15 मिनट लगते हैं।

जटिलताएं : कभी-कभी कॉर्नियल एपिथेलियम का घर्षण या संक्रमण (यदि पहले से एपिथेलियल दोष हो तो जोखिम अधिक) हो सकता है।

पैरामीटर	HRT III-RCM	Confoscan 4
प्रकाश स्रोत	डायोड लेज़र	हैलोजन प्रकाश
गहराई रिज़ॉल्यूशन	4 μm	25–27 μm
संपर्क	आवश्यक (TomoCap)	वैकल्पिक

Q क्या IVCM जांच में दर्द होता है?

A

आंखों में एनेस्थेटिक ड्रॉप डालने के कारण जांच के दौरान लगभग कोई दर्द नहीं होता। केवल कॉर्निया पर कैप के हल्के स्पर्श का अहसास होता है। जांच के बाद अस्थायी रूप से किसी विदेशी वस्तु का अहसास हो सकता है, लेकिन यह आमतौर पर जल्दी ठीक हो जाता है।

4. प्रकाशिकी सिद्धांत और उपकरण की विशेषताएं

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का मूल सिद्धांत ‘कॉन्फोकलिटी’ है ⁷⁾। प्रकाश व्यवस्था और संसूचन प्रणाली दोनों में पिनहोल छिद्र होते हैं, जो केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल तल से परावर्तित प्रकाश को चुनिंदा रूप से संसूचित करते हैं। फोकल तल के बाहर से बिखरा प्रकाश पिनहोल द्वारा अवरुद्ध हो जाता है, जिससे उच्च कंट्रास्ट और गहराई रिज़ॉल्यूशन प्राप्त होता है।

लेज़र स्कैनिंग प्रकार (HRT III-RCM) में 670 nm डायोड लेज़र एक बिंदु प्रकाश स्रोत के रूप में कार्य करता है, कॉर्निया पर बिंदु-दर-बिंदु स्कैन करके छवि बनाता है। फोकल तल की मोटाई (ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई) लगभग 4 µm होती है, जो कोशिकीय स्तर पर स्पष्ट क्रॉस-सेक्शनल छवियाँ प्रदान करती है।

स्लिट स्कैन प्रकार (Confoscan 4) में स्लिट के आकार की प्रकाश किरण से स्कैन किया जाता है, इसलिए स्लिट के लंबवत दिशा में ही वास्तविक कॉन्फोकलिटी प्राप्त होती है। इस कारण गहराई रिज़ॉल्यूशन 25-27 µm होता है, और लेज़र स्कैनिंग प्रकार की तुलना में छवि की तीक्ष्णता कम होती है।

IVCM की सीमाओं में शामिल हैं: केवल ग्रेस्केल छवियाँ (रंग अवलोकन संभव नहीं), अंतःकोशिकीय संरचनाओं का विभेदन असंभव, गंभीर कॉर्नियल अपारदर्शिता के मामलों में अवलोकन कठिन, अवलोकन स्थल का सटीक स्थानीयकरण कठिन, और परीक्षक के कौशल पर निर्भरता।

5. मुख्य नैदानिक अनुप्रयोग

IVCM के नैदानिक अनुप्रयोग विविध हैं।

कॉर्नियल संक्रमण के निदान में सहायक: कल्चर परीक्षण के पूरक के रूप में उपयोगी। फंगल हाइफे और अकैंथअमीबा सिस्ट का पता लगा सकता है, लेकिन अवलोकन निष्कर्षों की व्याख्या के लिए विशेषज्ञ ज्ञान आवश्यक है ⁸⁾। हर्पीज केराटाइटिस में कॉर्नियल तंत्रिकाओं में परिवर्तन को पकड़ा जा सकता है ⁸⁾। साइटोमेगालोवायरस कॉर्नियल एंडोथेलाइटिस में उल्लू की आँख के समावेशन देखे जा सकते हैं।

कॉर्नियल डिस्ट्रोफी का विभेदन: प्रत्येक डिस्ट्रोफी में विशिष्ट IVCM निष्कर्ष होते हैं, जो पैटर्न पहचान द्वारा गैर-आक्रामक विभेदन संभव बनाते हैं ¹⁾। आनुवंशिक परीक्षण या बायोप्सी से पहले स्क्रीनिंग के रूप में अत्यधिक उपयोगी। उपचार (PTK, DALK आदि) के बाद प्रभाव मूल्यांकन में भी लागू किया जा सकता है ¹⁾।

लिंबल स्टेम सेल कमी (LSCD) का मूल्यांकन: वोग्ट के पैलिसेड का गायब होना, कॉर्नियल एपिथेलियम का कंजंक्टिवल एपिथेलियम द्वारा प्रतिस्थापन, और गॉब्लेट कोशिकाओं का प्रकट होना निदान का आधार है ⁶⁾। बेसल एपिथेलियल कोशिका घनत्व का मापन LSCD की गंभीरता का मात्रात्मक मूल्यांकन कर सकता है ⁶⁾।

कॉर्नियल एडिमा और एंडोथेलियल रोगों का मूल्यांकन: IVCM मध्यम कॉर्नियल एडिमा के माध्यम से भी एंडोथेलियल कोशिकाओं का अवलोकन कर सकता है, इसलिए यह उन मामलों में विशेष रूप से उपयोगी है जहाँ स्पेक्युलर माइक्रोस्कोपी कठिन है ⁷⁾। फुक्स कॉर्नियल एंडोथेलियल डिस्ट्रोफी (FECD) में एंडोथेलियल कोशिका मूल्यांकन के अलावा, तंत्रिका घनत्व में कमी और डेंड्रिटिक कोशिका घनत्व में परिवर्तन भी पकड़े जा सकते हैं ⁷⁾।

कॉर्नियल तंत्रिकाओं का मूल्यांकन: सब-बेसल तंत्रिका जाल का मात्रात्मक मूल्यांकन न्यूरोट्रॉफिक केराटोपैथी के निदान और उपचार प्रभावशीलता के आकलन के लिए किया जाता है³⁾। सर्जिकल कॉर्नियल न्यूरोटाइज़ेशन के बाद तंत्रिका पुनर्जनन के मूल्यांकन में, IVCM द्वारा पोस्ट-ऑपरेटिव 6 महीने से 1 वर्ष में पुनर्जनन के संकेत देखे जाते हैं³⁾।

प्रणालीगत ऑटोइम्यून रोगों का शीघ्र पता लगाना: Sjögren सिंड्रोम में, कॉर्निया के केंद्र में तंत्रिका फाइबर घनत्व में कमी और सक्रिय डेंड्रिटिक कोशिकाओं में वृद्धि नैदानिक शुरुआत से पहले पाई जा सकती है⁴⁾। केंद्रीय कॉर्निया में 3 या अधिक प्रक्षेपण वाली 2 या अधिक सक्रिय डेंड्रिटिक कोशिकाओं की उपस्थिति प्रणालीगत ऑटोइम्यून रोगों के लिए 60% संवेदनशीलता और 77% विशिष्टता के साथ रिपोर्ट की गई है⁴⁾।

पोस्ट-ऑपरेटिव मूल्यांकन: LASIK, PRK के बाद फ्लैप मार्जिन और बोमैन झिल्ली में परिवर्तन, और तंत्रिका पुनर्जनन की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है²⁾। कॉर्नियल प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकृति का शीघ्र पता लगाने में भी इसका अनुप्रयोग है।

6. नवीनतम शोध और भविष्य की संभावनाएँ

स्वचालित छवि विश्लेषण: ACCMetrics सॉफ्टवेयर जैसे सब-बेसल तंत्रिका फाइबर के स्वचालित मात्रात्मक सिस्टम विकसित किए गए हैं²⁾। ये तंत्रिका फाइबर घनत्व, शाखा घनत्व, और टेढ़ापन जैसे पैरामीटर वस्तुनिष्ठ रूप से गणना करते हैं, जिससे परीक्षकों के बीच भिन्नता कम होती है।

रोगों के प्रीक्लिनिकल चरण का पता लगाना: Sjögren सिंड्रोम के मामलों में, एंटीबॉडी पॉजिटिविटी या नैदानिक लक्षणों के प्रकट होने से कई वर्ष पहले IVCM असामान्यताएं पाई गई हैं⁴⁾। यह सुझाव देता है कि IVCM ऑटोइम्यून रोगों के लिए एक स्क्रीनिंग टूल बन सकता है।

ड्राई आई के उपप्रकारों का वर्गीकरण: डेंड्रिटिक कोशिकाओं की आकृति और वितरण पैटर्न के विश्लेषण से इम्यून-मध्यस्थ ड्राई आई और वाष्पीकरण-प्रधान ड्राई आई में अंतर करना संभव हो सकता है⁴⁾।

पोस्ट-ऑपरेटिव तंत्रिका पुनर्जनन की निगरानी: कॉर्नियल न्यूरोटाइज़ेशन या कॉर्नियल क्रॉस-लिंकिंग के बाद तंत्रिका पुनर्जनन प्रक्रिया को IVCM द्वारा समय के साथ ट्रैक करने के लिए अनुसंधान चल रहा है³⁾। भविष्य में, इसके चिकित्सीय प्रभाव के वस्तुनिष्ठ अंत बिंदु के रूप में उपयोग की उम्मीद है।

कृत्रिम बुद्धिमत्ता का एकीकरण: गहन शिक्षण का उपयोग करके IVCM छवियों के स्वचालित वर्गीकरण और निदान प्रणाली विकसित की जा रही है, जिससे संक्रमणों के तेजी से निदान और कॉर्नियल डिस्ट्रोफी के स्वचालित विभेदन में अनुप्रयोग की उम्मीद है।

चिकित्सा जानकारी के संबंध में अस्वीकरण

इस लेख की सामग्री किसी चिकित्सा पेशेवर द्वारा निदान या उपचार का विकल्प नहीं है। यदि आंख में कोई असामान्यता महसूस हो, तो नेत्र रोग विशेषज्ञ से परामर्श करें।

7. संदर्भ

1. Ozturk HK, Ozates S, Ozkurt ZG, et al. In Vivo Confocal Microscopy in Avellino Corneal Dystrophy. Cureus. 2024;16(9):e68561.

2. Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.

3. Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.

4. Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.

5. Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.

6. Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.

7. Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.

8. 日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.