Microscopia Confocal (Microscopia Confocal da Córnea In Vivo)

Pontos-chave em resumo

1. O que é microscopia confocal?

A microscopia confocal é um microscópio de alta resolução baseado no princípio óptico de que a luz de iluminação e a luz observada compartilham o mesmo plano focal. Na oftalmologia, é aplicada para observação in vivo da córnea, sendo também utilizada na avaliação da distrofia endotelial de Fuchs ⁷⁾.

Os principais dispositivos atualmente usados na prática clínica são os dois tipos a seguir:

Tipo de varredura a laser (HRT III-RCM): Fabricado pela Heidelberg Engineering. Usa um laser de diodo de 670 nm como fonte de luz, lente objetiva de 63x e campo de visão de 400 × 400 μm. Possui alta resolução lateral de 1-2 μm e resolução de profundidade de cerca de 4 μm ¹⁾²⁾. É usado com uma tampa descartável de PMMA (TomoCap) e gel oftálmico, em contato com a córnea.

Tipo de varredura por fenda (Confoscan 4): Fabricado pela Nidek. Usa uma fonte de luz halógena e pode ser usado sem contato. Possui função de varredura automática, sendo relativamente fácil de operar, mas a resolução de profundidade é de apenas 25-27 μm. Atualmente está descontinuado.

O IVCM possui três modos de imagem. Varredura de seção captura imagens estáticas em uma única profundidade. Varredura de volume captura 30-40 seções consecutivas com intervalo de 2 μm. Varredura sequencial captura até 100 quadros de vídeo na mesma profundidade, adequada para observar mudanças dinâmicas.

Q O exame de microscopia confocal pode ser realizado em qualquer instalação?

O IVCM requer equipamento especializado e examinadores treinados, sendo instalado principalmente em hospitais universitários e centros oftalmológicos especializados. Não está disponível em todas as clínicas oftalmológicas, mas é particularmente útil no diagnóstico de infecções da córnea e distrofias da córnea, sendo os pacientes encaminhados conforme necessário.

2. Principais achados e significado clínico

Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R, et al. Corneal Sub-Basal Nerve Plexus in Non-Diabetic Small Fiber Polyneuropathies and the Diagnostic Role of In Vivo Corneal Confocal Microscopy. J Clin Med. 2023 Jan 13;12(2):664. Figure 1. PMCID: PMC9862881. License: CC BY.

Finas fibras hiper-reflexivas correndo paralelamente, mantendo o arranjo normal do plexo nervoso subbasal. É uma imagem de referência para o trajeto e densidade das fibras nervosas.

Achados da Córnea Normal

A IVCM permite a observação individual de cada camada da córnea.

Epitélio da Córnea: As células superficiais são poligonais, com 40–50 μm. As células aladas têm 20–30 μm com limites celulares nítidos, cerca de 5.000 células/mm². As células basais têm 8–10 μm com citoplasma escuro e limites claros (desmossomos), exibindo um padrão de favo de mel. A densidade de células basais é de 3.600–8.996 células/mm².

Membrana de Bowman: Observada como uma camada acinzentada amorfa com cerca de 10 μm de espessura. Feixes nervosos a atravessam.

Estroma da Córnea: Os ceratócitos aparecem escuros quando inativos e brilhantes, de forma ameboide, quando ativados. A densidade celular é maior no estroma anterior.

Membrana de Descemet: Observada como uma camada nebulosa com 6–10 μm de espessura. A estrutura celular geralmente não é identificável.

Endotélio da Córnea: Células hexagonais dispostas em mosaico. Diâmetro celular de cerca de 20 μm, densidade de 2.550–2.720 células/mm², diminuindo cerca de 0,6% ao ano com o envelhecimento.

Plexo Nervoso Subbasal: Observado como estruturas curvas em forma de contas localizadas imediatamente abaixo da membrana de Bowman ³⁾. Forma um padrão espiralado (whorl pattern) cerca de 1–2 mm inferonasal ao centro da córnea. O diâmetro das fibras é de 0,52–4,6 μm.

Células Dendríticas (Células de Langerhans): Distribuídas a 34 ± 3 células/mm² no centro da córnea e 98 ± 8 células/mm² na periferia. São um indicador de resposta imune.

Achados Anormais

Infecções da Córnea: Na ceratite fúngica, hifas filamentosas são claramente observadas no estroma ⁸⁾. A Acanthamoeba é detectada como cistos (esféricos com parede dupla), mas a diferenciação de células inflamatórias requer experiência ⁸⁾. As bactérias são difíceis de visualizar diretamente porque as células individuais são muito pequenas ⁵⁾.

Distrofias da Córnea: Na distrofia corneana de Avellino (GCD2), há depósitos granulares hiper-reflexivos na camada epitelial basal e aglomerados hiper-reflexivos irregulares no estroma superficial a médio ¹⁾. A distrofia corneana lattice tipo I é caracterizada por depósitos em rede e fibras ramificadas ¹⁾. A distrofia corneana macular mostra depósitos com limites indistintos, e a distrofia corneana cristalina de Schnyder exibe cristais em forma de agulha ¹⁾.

Ectasia da Córnea: No ceratocone, há diminuição da densidade de ceratócitos, correlacionada com a gravidade. Também são observadas rupturas na membrana de Bowman. Na ectasia corneana pós-PRK, há defeito na membrana de Bowman e diminuição de ceratócitos anteriores, mostrando um padrão IVCM diferente do ceratocone ²⁾.

3. Técnica e Método do Exame

O procedimento de exame IVCM é o seguinte:

Pré-tratamento: Administrar anestesia tópica (como oxibuprocaína). Aplicar gel oftálmico no TomoCap descartável (feito de PMMA) e fixá-lo na ponta da lente objetiva.

Realização do exame: Realizar a aplanação da córnea enquanto monitora o contato lente-córnea com uma câmera CCD. Ajustar o foco manualmente, observar sequencialmente da camada superficial da córnea (0 μm) para as camadas profundas. A fixação é muito importante, a cooperação do paciente é essencial. O tempo de exame é de cerca de 5 a 15 minutos.

Complicações: Podem ocorrer raramente abrasão do epitélio corneano, infecção (risco alto se houver defeito epitelial pré-existente).

Item	HRT III-RCM	Confoscan 4
Fonte de luz	Laser de diodo	Luz halógena
Resolução de profundidade	4 μm	25-27 μm
Contato	Necessário (TomoCap)	Também não necessário

Q O exame de IVCM dói?

Como é feita anestesia tópica com colírio, quase não há dor durante o exame. Apenas a sensação de leve contato da tampa com a córnea. Pode ocorrer sensação temporária de corpo estranho após o exame, mas geralmente desaparece rapidamente.

4. Princípios Ópticos e Características do Equipamento

O princípio básico do microscópio confocal é a “confocalidade” ⁷⁾. Tanto o sistema de iluminação quanto o de detecção possuem aberturas de pinhole, permitindo a detecção seletiva apenas da luz refletida do plano focal da objetiva. A luz espalhada de fora do plano focal é bloqueada pelo pinhole, proporcionando alto contraste e resolução de profundidade.

No tipo de varredura a laser (HRT III-RCM), um laser de diodo de 670 nm funciona como fonte de luz pontual, varrendo a córnea ponto a ponto para construir a imagem. A espessura do plano focal (espessura da seção óptica) é muito fina, cerca de 4 μm, fornecendo imagens de corte nítidas em nível celular.

No tipo de varredura por fenda (Confoscan 4), a varredura é feita com um feixe de luz em forma de fenda, portanto a verdadeira confocalidade é obtida apenas na direção perpendicular à fenda. Assim, a resolução de profundidade é de 25-27 μm, e a nitidez da imagem é inferior ao tipo de varredura a laser.

As limitações do IVCM incluem: apenas imagens em escala de cinza (sem observação colorida), incapacidade de resolver estruturas intracelulares, dificuldade de observação em casos de opacidade corneana grave, dificuldade de localização precisa do local de observação e dependência da habilidade do examinador.

5. Principais Aplicações Clínicas

As aplicações clínicas do IVCM são diversas.

Auxílio Diagnóstico em Infecções da Córnea: Útil como complemento ao exame de cultura. Pode detectar hifas de fungos e cistos de Acanthamoeba, mas a interpretação requer conhecimento especializado ⁸⁾. Na ceratite herpética, pode capturar alterações nos nervos corneanos ⁸⁾. Na endotelite corneana por citomegalovírus, podem ser observadas inclusões em olho de coruja.

Diferenciação de Distrofias da Córnea: Cada distrofia apresenta achados característicos ao IVCM, permitindo diferenciação não invasiva por reconhecimento de padrões ¹⁾. Muito útil como triagem antes de testes genéticos ou biópsia. Também pode ser aplicado na avaliação pós-tratamento (PTK, DALK, etc.) ¹⁾.

Avaliação da Deficiência de Células-Tronco do Limbo (LSCD): O diagnóstico baseia-se no desaparecimento das estruturas paliçadas de Vogt, substituição do epitélio corneano por epitélio conjuntival e aparecimento de células caliciformes ⁶⁾. A densidade de células epiteliais basais pode ser medida para avaliar quantitativamente a gravidade da LSCD ⁶⁾.

Avaliação de Edema Corneano e Doenças Endoteliais: O IVCM pode observar células endoteliais mesmo através de edema corneano moderado, sendo particularmente útil em casos onde a microscopia especular é difícil ⁷⁾. Na Distrofia Endotelial de Fuchs (FECD), além da avaliação das células endoteliais, também podem ser capturadas redução da densidade nervosa e alterações na densidade de células dendríticas ⁷⁾.

Avaliação do nervo corneano: A avaliação quantitativa do plexo nervoso subbasal é usada para o diagnóstico de ceratite neurotrófica e avaliação da eficácia do tratamento ³⁾. Após a cirurgia de neurotização corneana (surgical corneal neurotization), a IVCM mostra sinais de regeneração nervosa entre 6 meses e 1 ano de pós-operatório ³⁾.

Detecção precoce de doenças autoimunes sistêmicas: Na síndrome de Sjögren, a redução da densidade das fibras nervosas na córnea central e o aumento de células dendríticas ativadas podem ser detectados antes do início dos sintomas clínicos ⁴⁾. Se houver duas ou mais células dendríticas ativadas com três ou mais prolongamentos na córnea central, foi relatada sensibilidade de 60% e especificidade de 77% para doenças imunológicas sistêmicas ⁴⁾.

Avaliação pós-operatória: Utilizada para monitorar alterações na borda do flap e na membrana de Bowman após LASIK e PRK, bem como o acompanhamento da regeneração nervosa ²⁾. Também é aplicada na detecção precoce de rejeição após transplante de córnea.

6. Pesquisas recentes e perspectivas futuras

Análise automatizada de imagens: Sistemas automatizados de quantificação das fibras nervosas subbasais foram desenvolvidos, como o software ACCMetrics ²⁾. Parâmetros como densidade das fibras nervosas, densidade de ramificação e tortuosidade são calculados objetivamente, reduzindo a variabilidade entre examinadores.

Detecção da fase pré-clínica da doença: Em casos de síndrome de Sjögren, foram relatadas anormalidades na IVCM detectadas vários anos antes da soroconversão de anticorpos ou do aparecimento de sintomas clínicos ⁴⁾. Isso sugere o potencial da IVCM como ferramenta de triagem para doenças autoimunes.

Classificação de subtipos de olho seco: Através da análise da morfologia e padrão de distribuição das células dendríticas, é possível diferenciar entre olho seco imunomediado e olho seco evaporativo ⁴⁾.

Monitoramento da regeneração nervosa pós-operatória: Pesquisas estão em andamento para acompanhar o processo de regeneração nervosa após neurotização corneana ou crosslinking corneano usando IVCM seriada ³⁾. No futuro, espera-se que seja utilizado como um desfecho objetivo para avaliação da eficácia terapêutica.

Integração de inteligência artificial: Sistemas de classificação e diagnóstico automatizados de imagens de IVCM usando aprendizado profundo estão sendo desenvolvidos, com aplicações esperadas no diagnóstico rápido de infecções e na diferenciação automatizada de distrofias corneanas.

7. Referências

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Alvani A, Hashemi H, Pakravan M, et al. Corneal ectasia following PRK: a confocal microscopic case report. Arq Bras Oftalmol. 2024;87(6):e2023-0072.
Rathi A, Bothra N, Priyadarshini SR, et al. Neurotization of the human cornea - A comprehensive review and an interim report. Indian J Ophthalmol. 2022;70(6):1905-1917. doi:10.4103/ijo.IJO_2030_21. PMID:35647955; PMCID:PMC9359267.
Mercado CL, Galor A, Felix ER, et al. Confocal Microscopy Abnormalities Preceding Antibody Positivity and Manifestations of Sjogren’s Syndrome. Ocul Immunol Inflamm. 2023;31(5):1004-1009.
Austin A, Lietman T, Rose-Nussbaumer J. Update on the management of infectious keratitis. Ophthalmology. 2017;124(11):1678-1689. doi:10.1016/j.ophtha.2017.05.012. PMID:28942073; PMCID:PMC5710829.
Deng SX, Borderie V, Chan CC, et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3):364-375.
Aggarwal S, Kheirkhah A, Cavalcanti BM, et al. In vivo confocal microscopy in Fuchs endothelial corneal dystrophy: a review. Eye Contact Lens. 2020;46(5):S46-S52.
日本眼感染症学会. 感染性角膜炎診療ガイドライン（第3版）. 日眼会誌. 2023.