La citologia per impronta (impression cytology) è un esame mini-invasivo che consiste nell’applicare una carta filtro di acetato di cellulosa sulla superficie oculare per prelevare le cellule epiteliali superficiali, consentendo analisi istologiche, immunoistochimiche e di biologia molecolare.
Nel 1977, Egbert et al. hanno sviluppato la tecnica per lo studio delle cellule caliciformi congiuntivali, e successivamente Tseng l’ha migliorata, ampliandone l’applicazione clinica alle malattie della superficie oculare.
La diagnosi patologica si divide in istologia e citologia. La citologia non fornisce informazioni sull’architettura tissutale, quindi è considerata un esame complementare all’istologia, ma in oftalmologia la citologia è molto utile perché l’istologia è altamente invasiva.
La citologia per impronta stacca l’epitelio con carta filtro, prelevando le cellule come un foglio bidimensionale. Lo striscio congiuntivale viene eseguito raschiando con un bastoncino cotonato o una spatola citologica. La citologia per impronta è superiore nella valutazione della distribuzione e densità delle cellule caliciformi.
Poiché la citologia per impronta è un metodo di esame e non una malattia con «sintomi», questa sezione descrive i reperti osservati nei campioni prelevati e il loro significato clinico.
La citologia per impronta è applicabile al seguente ampio spettro di malattie e condizioni.
Malattie della superficie oculare
Tumori
I tumori epiteliali squamosi della superficie oculare sono classificati in neoplasia intraepiteliale congiuntivale (CIN) e carcinoma squamoso invasivo. I principali fattori di rischio sono i seguenti:
Confrontare i tipi di carta da filtro.
Membrana di acetato di cellulosa
Filtro Millipore con pori da 0,22 µm: la scelta standard considerata la migliore.
Forma: tagliato in strisce di 5 mm (un’estremità quadrata, l’altra affusolata). Segnare la superficie per l’orientamento.
Uso per PCR: utilizzare filtri circolari di diametro 10 mm.
Membrana di nitrocellulosa
Strisce trapezoidali (circa 3×6 mm): forma standard.
Necessità di distinguere il dritto dal rovescio: il lato liscio è il dritto. Il lato ruvido (rovescio) aderisce all’epitelio congiuntivale.
Immunoistochimica: la membrana di nitrocellulosa è adatta.
Membrana Biopore
Applicazione nella diagnosi di insufficienza delle cellule staminali limbari: opzione insieme ad acetato di cellulosa e nitrocellulosa.
Caratteristiche comuni: può prelevare 1-3 strati di epitelio superficiale.
L’area di prelievo presenta un difetto epiteliale, che può causare dolore oculare dopo il ritorno a casa. Spiegare al paziente in anticipo e prescrivere colliri con protettore corneale.
Nel sito di prelievo può verificarsi un difetto epiteliale, che può causare dolore oculare dopo il ritorno a casa. Spiegare prima dell’esame e prescrivere colliri protettivi corneali. Nella maggior parte dei casi, il difetto si ripara spontaneamente entro pochi giorni.
I reperti citologici per impronta per ciascuna malattia sono mostrati di seguito.
Alcuni considerano la citologia per impronta il gold standard per la diagnosi di insufficienza delle cellule staminali limbari (sebbene non sia ampiamente utilizzata clinicamente).
La comparsa di cellule caliciformi sulla cornea è una prova diretta di congiuntivalizzazione e costituisce un criterio diagnostico. Applicare un filtro al centro della cornea per verificare la presenza di cellule caliciformi.
L’accuratezza predittiva della citologia per impronta per ciascuna diagnosi tumorale è mostrata di seguito.
| Malattia | Accuratezza diagnostica predittiva |
|---|---|
| Tumore epiteliale squamoso della superficie oculare (diagnosi istologica) | 80% |
| Displasia moderata | 77% |
| Cheratite da Acanthamoeba | 94,6% |
Il gold standard per la diagnosi definitiva dei tumori epiteliali squamosi della superficie oculare è la biopsia escissionale. La citologia per impronta e la citologia esfoliativa non consentono di distinguere le lesioni superficiali da quelle invasive e pertanto non vengono utilizzate per la diagnosi definitiva.
Nei tumori epiteliali squamosi della superficie oculare su sfondo di cheratocongiuntivite primaverile cronica, la differenziazione dall’iperplasia pseudoepiteliomatosa è difficile. Se la citologia per impronta rivela cellule epiteliali pigmentate pleomorfe, ciò può essere un indizio sospetto di tumore epiteliale squamoso della superficie oculare1).
L’accuratezza predittiva della diagnosi istologica è dell’80% e per una diagnosi definitiva è necessaria una biopsia escissionale. Poiché la citologia per impronta non consente di distinguere le lesioni invasive da quelle intraepiteliali, è considerata uno strumento diagnostico ausiliario.
Il filtro in acetato di cellulosa preleva lo strato più superficiale (1-3 strati) dell’epitelio della superficie oculare insieme alle secrezioni mucose.
Quando il filtro è ben aderente, può essere prelevato come un foglio cellulare stratificato di più strati, consentendo una valutazione bidimensionale della morfologia, distribuzione e densità cellulare.
Sulla congiuntiva normale, le cellule caliciformi sono distribuite su tutta la congiuntiva. L’infiammazione cronica e l’occhio secco grave distruggono le cellule caliciformi e causano metaplasia epiteliale (squamosa). Nell’insufficienza delle cellule staminali del limbo, l’esaurimento delle cellule staminali del limbo porta alla perdita della capacità di rinnovare l’epitelio corneale e l’epitelio congiuntivale ricopre la superficie corneale (congiuntivalizzazione). L’identificazione di cellule caliciformi sulla cornea mediante citologia per impronta è una prova di questa congiuntivalizzazione.
Sebbene la citologia per impronta sia minimamente invasiva, provoca un difetto epiteliale nel sito di prelievo, quindi non è un esame completamente non invasivo. Negli ultimi anni si sono sviluppate le seguenti nuove modalità.
Le caratteristiche di ciascuna modalità diagnostica sono mostrate di seguito.
| Modalità | Caratteristiche | Note |
|---|---|---|
| Citologia per impronta | Valutazione possibile delle cellule caliciformi e immunoistochimica | Valutazione solo di 1-3 strati, difetto epiteliale presente |
| Microscopia confocale in vivo | Quantificazione cellulare con risoluzione di 1-10 μm | Richiede cooperazione del paziente per 5-15 minuti |
| Tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione | Distinzione tra lesioni invasive e intraepiteliali | Spessore epiteliale >120 μm suggerisce invasione |
La microscopia confocale in vivo consente di osservare le cellule corneali e congiuntivali con una risoluzione di 1-10 μm. Permette la quantificazione cellulare, ma richiede la collaborazione del paziente per 5-15 minuti.
La tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione (OCT del segmento anteriore ad alta risoluzione) è utile per distinguere le lesioni invasive da quelle intraepiteliali identificando un ispessimento epiteliale (superiore a 120 μm).
Per i tumori epiteliali squamosi della superficie oculare sono state studiate diverse terapie farmacologiche, tra cui mitomicina C 0,04%, 5-fluorouracile, interferone alfa-2b, farmaci anti-VEGF e cidofovir, ma non esistono ancora linee guida ufficiali.
In un uomo di 24 anni con tumore epiteliale squamoso della superficie oculare su base di cheratocongiuntivite primaverile cronica, la citologia per impronta ha rilevato cellule epiteliali polimorfe contenenti pigmento. Dopo due cicli di trattamento con mitomicina C 0,04%, è stata osservata una riduzione del tumore. La successiva biopsia escissionale (con margine di 4 mm, tecnica no-touch, crioterapia e trapianto di membrana amniotica) ha mostrato displasia lieve-moderata e non è stata osservata recidiva a 6 mesi di follow-up1). La citologia per impronta può essere applicata anche per il monitoraggio dopo trattamento con mitomicina C.
La microscopia confocale in vivo e la tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione sono modalità non invasive in via di sviluppo. La tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione è utile per distinguere le lesioni invasive utilizzando l’ispessimento epiteliale (>120 μm) come indicatore, ma entrambe contengono elementi di ricerca. La citologia per impronta mantiene il suo valore unico grazie alla capacità di identificare le cellule caliciformi e alla colorazione immunoistochimica.
