Test di clearance lacrimale (Fluorescein Dye Dilution Test)
1. Che cos’è il test di clearance lacrimale?
Sezione intitolata “1. Che cos’è il test di clearance lacrimale?”Il test di clearance lacrimale (Fluorescein Dye Dilution Test) è un termine generale per indicare un gruppo di esami oftalmologici che valutano la velocità di eliminazione (turnover) della lacrima instillando fluoresceina nel sacco congiuntivale e misurando, dopo un certo intervallo di tempo, la quantità (o concentrazione) di fluoresceina residua nella lacrima.
La lacrima è secreta dalla ghiandola lacrimale e dalle ghiandole lacrimali accessorie, e viene drenata attraverso le vie lacrimali (dotto nasolacrimale). L’equilibrio tra produzione ed eliminazione si chiama “clearance lacrimale” e, quando questa funzione si riduce, i farmaci o i conservanti instillati nel sacco congiuntivale possono rimanere a lungo e danneggiare la superficie oculare. La riduzione della clearance lacrimale è chiaramente collocata nelle linee guida per la gestione dell’occhio secco1) come fattore di rischio a monte del meccanismo centrale dell’occhio secco (tipo da deficit lacrimale).
Le principali implicazioni cliniche sono le seguenti.
- Diagnosi differenziale dei sottotipi di occhio secco (tipo da deficit lacrimale vs tipo evaporativo)
- Differenziazione dall’epifora funzionale (senza ostruzione delle vie lacrimali)
- Valutazione della funzione della ghiandola lacrimale nella secchezza oculare grave, come la sindrome di Sjögren, la GVHD e il pemfigoide oculare cicatriziale
- Valutazione del tempo di ritenzione del film lacrimale come base per la scelta dei colliri (con BAK / senza conservanti)
La fluoresceina è un colorante fluorescente idrosolubile della famiglia delle xantene, con lunghezza d’onda di eccitazione di 494 nm e lunghezza d’onda di emissione di 521 nm. Poiché l’intensità di fluorescenza nel sacco congiuntivale è proporzionale alla concentrazione, può essere valutata facilmente in modo semiquantitativo sotto il filtro blu cobalto del biomicroscopio a fessura.
La riduzione della clearance lacrimale non si limita a una diminuzione del volume delle lacrime, ma comporta anche l’accumulo di citochine infiammatorie e conservanti sulla superficie oculare, in particolare BAK: benzalconio cloruro. Le Linee guida per la pratica clinica dell’occhio secco1) definiscono chiaramente la riduzione della clearance lacrimale come un “fattore di rischio a monte” dell’occhio secco e forniscono informazioni importanti che influenzano direttamente la classificazione della malattia e la scelta del trattamento, come l’uso di colliri senza conservanti o l’indicazione dei tappi lacrimali.
2. Tecnica e procedura dell’esame
Sezione intitolata “2. Tecnica e procedura dell’esame”
Test di scomparsa della fluoresceina (Fluorescein Dye Disappearance Test: FDDT)
Sezione intitolata “Test di scomparsa della fluoresceina (Fluorescein Dye Disappearance Test: FDDT)”Il test di persistenza del colorante è il metodo di valutazione della clearance più ampiamente utilizzato. Non richiede attrezzature speciali e può essere eseguito immediatamente in ambulatorio; la procedura standard è la seguente.
- Instillazione di fluoresceina: colorare il sacco congiuntivale del fornice inferiore con una striscia reattiva di fluoresceina (o 1–2 µL di una soluzione di fluoresceina all’1–2%)
- Attesa: attendere 5 minuti sbattendo naturalmente le palpebre (il tempo standard di valutazione è 5 minuti; può essere aggiunta anche una valutazione a 15 minuti).
- Osservazione: osservare la quantità di colorante residuo sotto il filtro blu cobalto del microscopio a lampada a fessura.
- Punteggio: registrare come punteggio semi-quantitativo da Grade 0 a 3.
Questo test si basa sul principio che, più rapidamente vengono drenate le lacrime, più rapidamente scompare il colorante.
Calcolo del Tear Function Index (TFI)
Sezione intitolata “Calcolo del Tear Function Index (TFI)”Il Tear Function Index (TFI) è un indice di valutazione composito che combina il test di Schirmer e il test di scomparsa del colorante, ed è citato anche come parametro di valutazione della funzione lacrimale nelle Linee guida diagnostiche per l’occhio secco 1).
La formula è la seguente.
TFI = valore di Schirmer (5 minuti, mm) ÷ punteggio di ritenzione del colorante (Grade 1–3)
- TFI alto: maggiore produzione lacrimale e buon deflusso
- TFI basso: ridotta produzione lacrimale, ridotto deflusso, o entrambi
Se il punteggio di ritenzione del colorante è “0 (nessuna ritenzione)”, il denominatore diventa 0; nella pratica clinica viene quindi corretto al valore minimo di 0,5, oppure registrato qualitativamente come “deflusso normale”.
Fluorofotometria
Sezione intitolata “Fluorofotometria”Quando è necessaria una valutazione quantitativa più precisa, si utilizza un metodo di misurazione del flusso con fluorofotometro.
- Instillare una soluzione di fluoresceina a concentrazione nota
- Misurare a intervalli regolari la concentrazione di fluoresceina nel film lacrimale
- Calcolare la portata lacrimale (µL/min) dalla curva di decadimento della concentrazione
Questo metodo consente una valutazione quantitativa precisa, ma richiede apparecchiature speciali, quindi è usato soprattutto nei centri di ricerca3).
In combinazione con l’osservazione del menisco lacrimale
Sezione intitolata “In combinazione con l’osservazione del menisco lacrimale”Osservando l’altezza del menisco lacrimale inferiore sotto colorazione con fluoresceina al microscopio a lampada a fessura, si possono valutare contemporaneamente la quantità di ristagno lacrimale e la velocità di drenaggio. Combinandola con la misurazione quantitativa dell’altezza del menisco lacrimale mediante OCT del segmento anteriore (valore normale ≥ 0,2 mm), è possibile una valutazione più oggettiva del clearance.
3. Interpretazione dei valori normali e anomali
Sezione intitolata “3. Interpretazione dei valori normali e anomali”Classificazione in gradi del test di ritenzione del colorante
Sezione intitolata “Classificazione in gradi del test di ritenzione del colorante”Di seguito è riportata una valutazione semiquantitativa basata sulla quantità di colorante residuo dopo 5 minuti.
| Grado | Colorante residuo dopo 5 minuti | Significato clinico |
|---|---|---|
| 0 | nessuno | clearance normale |
| 1 | molto lieve (fluorescenza debole) | borderline (possibile lieve riduzione) |
| 2 | ritenzione moderata (rimane una fluorescenza evidente) | riduzione della clearance lacrimale |
| 3 | ritenzione marcata (la fluorescenza intensa persiste su un’ampia area) | riduzione grave (sospettare sindrome di Sjögren, GVHD, ecc.) |
Il grado 2 o superiore è un riferimento per valutare una riduzione della clearance lacrimale. Il grado 1 è al limite e va valutato insieme agli altri reperti degli esami lacrimali.
Valori di riferimento della velocità di turnover lacrimale
Sezione intitolata “Valori di riferimento della velocità di turnover lacrimale”La normale velocità di turnover lacrimale è circa 16%/min (ogni minuto, circa il 16% delle lacrime nel sacco congiuntivale viene sostituito da lacrime nuove)2). Quando si riduce, le sostanze nel sacco congiuntivale (conservanti, metaboliti, citochine infiammatorie, ecc.) tendono a ristagnare.
Nella sindrome di Sjögren e in caso di marcata riduzione della secrezione lacrimale, la velocità di turnover può diminuire in modo significativo (per esempio, a 5%/min o meno).
Il fatto che la fluoresceina rimanga nel sacco congiuntivale dopo 5 minuti indica che la velocità di deflusso delle lacrime (clearance) è ridotta. Quando la clearance diminuisce, i farmaci instillati e i conservanti (come BAK, ecc.) restano sulla superficie oculare più a lungo del normale, aumentando la tossicità per le cellule epiteliali della superficie oculare. Inoltre, si crea un ambiente in cui le citochine infiammatorie (come IL-1β e TNF-α) si concentrano, facilitando l’ingresso nel circolo di peggioramento dell’occhio secco. In particolare, nella sindrome di Sjögren e nella GVHD si osserva spesso una marcata ritenzione di grado 3.
4. Significato clinico e indicazioni
Sezione intitolata “4. Significato clinico e indicazioni”Diagnosi del tipo di occhio secco
Sezione intitolata “Diagnosi del tipo di occhio secco”Il test di clearance lacrimale viene utilizzato nella diagnosi differenziale del tipo di occhio secco come segue.
Occhio secco da carenza della componente acquosa (aqueous-deficient dry eye)：
- Poiché la produzione lacrimale diminuisce, il turnover lacrimale si riduce in modo marcato
- Nel test di ritenzione del colorante, mostra spesso punteggi elevati di grado 2-3
- Anche il valore di Schirmer è basso (5 mm o meno) e il TFI si riduce
Forma evaporativa di occhio secco (evaporative dry eye):
- Poiché la produzione lacrimale è relativamente պահպանata, il clearance è normale o solo lievemente ridotto
- Il test di ritenzione del colorante è spesso di grado 0–1
- Il BUT si accorcia, ma il valore di Schirmer è spesso entro il range normale
Differenziazione dall’epifora funzionale (epiphora)
Sezione intitolata “Differenziazione dall’epifora funzionale (epiphora)”Nei pazienti il cui sintomo principale è la lacrimazione, il test di clearance lacrimale aiuta a distinguere se la lacrimazione è dovuta a un’ostruzione delle vie lacrimali o a un’epifora funzionale (le vie lacrimali sono pervie ma c’è ipersecrezione).
- In caso di ostruzione delle vie lacrimali: il test di ritenzione del colorante mostra una ritenzione marcata (grado 2–3)
- Nell’epifora da ipersecrezione: la ritenzione del colorante è lieve o normale (grado 0–1) e il test di ritenzione scompare rapidamente
Valutazione dell’occhio secco grave
Sezione intitolata “Valutazione dell’occhio secco grave”È noto che la clearance lacrimale si riduce in modo marcato nelle seguenti malattie.
- Sindrome di Sjögren (primaria e secondaria): la secrezione diminuisce drasticamente per distruzione autoimmune delle ghiandole lacrimali
- GVHD dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche: attacco immunitario alle ghiandole lacrimali
- Pemfigoide cicatriziale oculare: alterazione delle vie lacrimali e della funzione di drenaggio dovuta alla cicatrizzazione congiuntivale
- Sequele della sindrome di Stevens-Johnson: riduzione della produzione lacrimale dovuta alla distruzione delle ghiandole lacrimali accessorie
Base per la scelta di colliri senza BAK
Sezione intitolata “Base per la scelta di colliri senza BAK”Nei pazienti con una marcata riduzione della clearance lacrimale, i colliri contenenti BAK (cloruro di benzalconio) rimangono sulla superficie oculare più a lungo del normale. Le linee guida per l’occhio secco1) raccomandano l’uso di colliri senza BAK nell’occhio secco con marcata riduzione della secrezione lacrimale, e il test di clearance lacrimale fornisce una base oggettiva per questa decisione terapeutica.
5. Indicazioni terapeutiche correlate
Sezione intitolata “5. Indicazioni terapeutiche correlate”Il piano terapeutico basato sui risultati della valutazione della clearance lacrimale è il seguente.
Riduzione lieve-moderata della clearance (Grade 1–2)：
- Instillazione frequente di lacrime artificiali (preferire formulazioni senza conservanti)
- Collirio di diquafosol sodico al 3% (6 volte al giorno): stabilizza lo strato mucinico e lo strato acquoso1)
- Collirio di rebamipide al 2% (4 volte al giorno): favorisce la produzione di mucina1)
Riduzione marcata della clearance (Grade 3)：
- La scelta di colliri senza BAK è essenziale1)
- Inserimento del plug punctale: riduce il deflusso lacrimale e mantiene le lacrime sulla superficie oculare1)
- Collirio di ciclosporina: si prevede che riduca l’infiammazione delle ghiandole lacrimali e aiuti a recuperare la secrezione
In generale, occhio secco da carenza acquosa:
- Nelle linee guida per la pratica clinica sull’occhio secco1), i plug punctali sono considerati un trattamento standard per l’occhio secco da carenza acquosa
- I plug punctali in silicone possono essere inseriti e rimossi facilmente e possono essere eseguiti come procedura ambulatoriale
6. Rapporto tra principi di misurazione ed altri esami
Sezione intitolata “6. Rapporto tra principi di misurazione ed altri esami”Proprietà di fluorescenza della fluoresceina e principio di misurazione
Sezione intitolata “Proprietà di fluorescenza della fluoresceina e principio di misurazione”La fluoresceina emette fluorescenza quando viene eccitata a 494 nm (luce blu cobalto) ed emette a 521 nm (verde). Poiché la quantità di fluoresceina nel sacco congiuntivale è proporzionale all’intensità della fluorescenza, è possibile una valutazione semiquantitativa mediante osservazione attraverso il filtro blu cobalto del microscopio a lampada a fessura.
Principali indicatori relativi alla produzione e al drenaggio delle lacrime:
- Tasso normale di turnover: circa 16%/min (circa il 16% del volume del sacco congiuntivale viene rinnovato ogni minuto)2)
- Flusso lacrimale normale: circa 1–2 µL/min (valore misurato con fluorophotometry)3)
- Volume di lacrime trattenuto nel sacco congiuntivale: circa 7–9 µL (a occhi aperti, a riposo)
Da questi valori si capisce che, normalmente, la maggior parte del farmaco instillato viene eliminata entro 5–10 minuti. Se la clearance è ridotta, questo tempo di eliminazione si prolunga.
Relazione complementare tra gli esami lacrimali
Sezione intitolata “Relazione complementare tra gli esami lacrimali”L’esame della clearance lacrimale è più informativo se associato ad altri esami lacrimali, piuttosto che usato da solo.
Test BUT (tempo di rottura del film lacrimale):
- Valuta la ‘qualità (stabilità)’ delle lacrime
- Criterio principale nelle Linee guida cliniche per l’occhio secco1) (5 secondi o meno è considerato positivo)
- Si accorcia in particolare nel tipo evaporativo
- Valuta la ‘quantità di secrezione’ delle lacrime (5 mm o meno è usato come riferimento di riduzione della secrezione)
- TFI può essere calcolato insieme al test di clearance lacrimale come indicatore di riferimento1)
Misurazione del menisco lacrimale con OCT del segmento anteriore:
- Un’altezza del menisco lacrimale inferiore ≥ 0,2 mm è considerata un valore normale di riferimento
- Non invasiva, quantitativa e altamente riproducibile
- È utile per la valutazione oggettiva del volume lacrimale
Misurazione dell’osmolarità lacrimale:
- 316 mOsm/L o più è usato come soglia positiva per l’occhio secco
- L’elevata osmolarità è un fattore che favorisce l’infiammazione della superficie oculare
Il turnover lacrimale è la velocità con cui le lacrime nel sacco congiuntivale vengono sostituite da lacrime nuove. Normalmente si rinnovano a un ritmo di circa il 16% al minuto, e i farmaci instillati, i corpi estranei e i prodotti del metabolismo vengono continuamente lavati via dalla superficie oculare. Quando il turnover diminuisce, si verifica un “ristagno lacrimale”, che facilita l’accumulo di conservanti come BAK e di citochine infiammatorie. Il test di clearance lacrimale è l’unico esame clinico che valuta questo turnover, ed è particolarmente utile nei pazienti in cui si sospetta una marcata riduzione della secrezione lacrimale.
7. Ricerche più recenti e prospettive future
Sezione intitolata “7. Ricerche più recenti e prospettive future”Ricerca su metodi non invasivi di valutazione del clearance
Sezione intitolata “Ricerca su metodi non invasivi di valutazione del clearance”Poiché la fluoresceina è un colorante fluorescente idrosolubile, è necessario instillarla direttamente nell’occhio. Negli ultimi anni, l’osservazione non invasiva della dinamica del menisco lacrimale mediante OCT del segmento anteriore e la valutazione della stabilità dello strato lipidico mediante interferometria lacrimale sono stati studiati come indicatori surrogati del clearance lacrimale. Questi metodi consentono di valutare la dinamica lacrimale senza colorazione con fluoresceina, rendendo possibile la misurazione in uno stato fisiologico più naturale.
Quantificazione mediante fluorofotometria
Sezione intitolata “Quantificazione mediante fluorofotometria”Nei centri di ricerca vengono effettuate misurazioni precise del clearance lacrimale con fluorofotometro. Questo metodo consente di calcolare con maggiore precisione il flusso lacrimale (µL/min) ed è utilizzato anche negli studi farmacocinetici e nella valutazione della biodisponibilità dei colliri 3). Se la miniaturizzazione e la riduzione dei costi progrediranno, in futuro potrebbe diventare pratico per l’uso nei comuni ambulatori.
Applicazione nel clearance delle citochine lacrimali
Sezione intitolata “Applicazione nel clearance delle citochine lacrimali”La riduzione del clearance lacrimale porta a un aumento delle concentrazioni di citochine infiammatorie (IL-1β, TNF-α, MMP-9, ecc.) nel sacco congiuntivale. Da questo punto di vista, si prevede che combinarlo con biomarcatori lacrimali (come il test MMP-9) migliori l’accuratezza diagnostica dell’«occhio secco infiammatorio».
8. Riferimenti
Sezione intitolata “8. Riferimenti”- ドライアイ研究会診療ガイドライン作成委員会（島﨑潤, 横井則彦, 渡辺仁, 他）. ドライアイ診療ガイドライン. 日本眼科学会雑誌. 2019;123(5):489-592.
- Mishima S, Gasset A, Klyce SD, Baum JL.. Determination of tear volume and tear flow. Invest Ophthalmol. 1966;5(3):264-276. PMID:5947945.
- Xu KP, Tsubota K. Correlation of tear clearance rate and fluorescein staining of the corneal and conjunctival epithelium. Br J Ophthalmol. 1995;79(12):1042-1047.