Viral vektörler kullanılarak yapılan gen tedavisi, işlevini yitirmiş genleri tamamlama veya onarma tekniğidir. Göz, immün ayrıcalık (immune privilege), kan-retina bariyeri ve terminal farklılaşmış hücreler olmak üzere üç özelliği sayesinde gen tedavisi için özellikle uygun bir organdır.
İmmün ayrıcalık, gözün görme işlevini korumak için inflamatuar yanıtı sınırladığı mekanizmadır. İmmün düzenleyici moleküller, inflamatuar hücreleri baskılayarak transfer edilen gene karşı immün yanıtı azaltır. Kan-retina bariyeri ilacın sistemik maruziyetini sınırlayarak yan etkileri azaltır. Terminal farklılaşmış hücrelerden (fotoreseptörler ve RPE hücreleri) oluşması, kromozomal entegrasyon ve insersiyonel mutajenez riskini doğal olarak düşürür.
Kalıtsal retina hastalıklarına (IRD) neden olan 270’ten fazla gen mutasyonu keşfedilmiştir ve mutasyonlar esas olarak fotoreseptörlerde veya RPE hücrelerinde ortaya çıkar. IRD’lerin çoğu tek gen hastalığı olduğu için gen replasman tedavisi için ideal hedeflerdir.
Aralık 2017’de FDA, Spark Therapeutics tarafından geliştirilen voretigen neparvovek (ticari adı: Luxturna) onayladı. EMA da 2018’de onaylamıştır5). Bu, RPE65 geninin iki alel mutasyonuyla ilişkili IRD’leri (LCA2 ve retinitis pigmentoza) hedef alan dünyanın ilk oftalmik gen tedavisi ürünüdür.
Göz, immün ayrıcalık, kan-retina bariyeri ve kapalı bir boşluk özelliklerine sahiptir; bu sayede az miktarda vektör hedef hücrelere verimli bir şekilde ulaştırılabilir. Ayrıca retina, bölünmeyen terminal farklılaşmış hücrelerden oluştuğu için gen stabil ve uzun süreli olarak ifade edilir. Bu faktörler oftalmik gen tedavisini hızlandırmıştır.
Gen tedavisine uygun kalıtsal retina hastalıklarının semptomları hastalığa göre değişmekle birlikte, başlıca semptomlar şunlardır:
LCA2'de Fundus Bulguları
Kemik korpüskülü benzeri pigment birikimleri: Retina damarları çevresinde ve orta periferde siyah granüler birikimler. RP’nin klasik bulgusu.
Retina damarlarında incelme: İlerlemeyle birlikte arterler incelir.
Optik disk solukluğu: İleri evrede görülür.
FAF azalması: Görsel döngü bozukluğu nedeniyle otofloresans azalır. RPE65-IRD için karakteristiktir.
VN Tedavisi Sonrası Eşlik Eden Bulgular
Koryoretinal atrofi (CRA): Cerrahi sonrası %13-28 oranında bildirilmiştir. Retinotomi bölgesi dışında da oluşabilir2).
Subretinal bleb oluşumu: Subretinal enjeksiyon sonrası fotoreseptörlerin ve RPE’nin geçici olarak ayrışması durumu.
Vitrit: Tedavi sonrası erken dönemde ortaya çıkan inflamatuar yanıt
Arka subkapsüler katarakt: Uzun süreli olgularda bildirilmiştir1)
Oftalmik gen tedavisinde kullanılan başlıca viral vektörler AAV, adenovirüs ve lentivirüstür. Her birinin özellikleri aşağıda verilmiştir5).
| Vektör | Nükleik asit | Kapasite | İmmünojenite | İnsersiyonel mutajenez |
|---|---|---|---|---|
| AAV | Tek iplikli DNA | Yaklaşık 4.7 kb | Düşük | Düşük (epizomal) |
| Adenovirüs | Çift iplikli DNA | Maksimum 37 kb | Yüksek | Düşük (epizomal) |
| Lentivirüs | Tek iplikli RNA | 8-10 kb | Orta | Evet (kromozomal entegrasyon) |
AAV, Parvoviridae ailesine ait, zarfsız, tek iplikli bir DNA virüsüdür. Şu anda retina gen tedavisinde en yaygın kullanılan vektördür5).
AAV’nin avantajları şunlardır5):
13 farklı serotip tanımlanmıştır ve AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 oftalmolojide başlıca kullanılanlardır. AAV2, vitreus tarafından iç retinaya enfeksiyonda başarılıdır ancak dış retinaya ulaşımı sınırlıdır. AAV2 ve AAV8’in subretinal enjeksiyonu sırasıyla RPE ve fotoreseptör hücrelerine etkili transfer sağlar.
Genel popülasyonun yaklaşık %70’i AAV2’ye, %38’i AAV8’e karşı önceden var olan antikorlara sahiptir. Bu nötralize edici antikorlar gen ifadesinin azalmasıyla ilişkilidir, bu nedenle AAV8 tabanlı vektörler AAV2’den daha etkili olabilir.
Paketleme kapasitesi yaklaşık 4.7-4.8 kb ile sınırlıdır ve ABCA4 (Stargardt hastalığı) veya MYO7A (Usher sendromu) gibi büyük genleri taşıyamaz 5).
Zarsız, çift sarmallı bir DNA virüsüdür ve 37 kb’ye kadar gen taşıyabilir. Enjeksiyondan sonra 48 saat içinde ekspresyonun başlaması gibi hızlı bir özelliğe sahiptir. Ancak güçlü bir bağışıklık tepkisine neden olur ve ateş, karaciğer hasarı, sistemik enfeksiyon ve ölüm gibi ciddi yan etkiler bildirilmiştir; bu nedenle şu anda oftalmolojide yalnızca bir retinoblastom araştırma çalışmasında kullanılmaktadır 5).
HIV, at enfeksiyöz anemi virüsü (EIAV) vb.‘den türetilen tek sarmallı bir RNA retrovirüsüdür. 8-10 kb gen taşıyabilir ve RPE hücrelerine transfeksiyonda etkilidir ancak fotoreseptörleri etkili bir şekilde hedefleyemez. AAV ve adenovirüsten farklı olarak, tamamlayıcı DNA’yı kromozoma entegre eder ve bu da insersiyonel mutajenez riski taşır 5). Stargardt hastalığı ve Usher sendromu (USH1B) klinik çalışmalarında EIAV vektörü kullanılmıştır.
AAV’nin kapasitesi yaklaşık 4.7-4.8 kb ile sınırlı olduğundan, ABCA4 (Stargardt hastalığı), MYO7A (Usher sendromu) ve EYS gibi daha büyük genlerin kodlanmasını gerektiren hastalıklar AAV ile tedavi edilemez 5). Bu durumda lentivirüs vektörü bir seçenek haline gelir, ancak kromozomal entegrasyon riski taşır.
Oftalmik viral gen tedavisinde başlıca üç uygulama yolu vardır. Her yolun özellikleri ve endikasyonları aşağıda verilmiştir.
İntravitreal Enjeksiyon
İnvazivlik: En az invaziv. Ayakta, lokal anestezi altında uygulanabilir
Hedef bölge: Esas olarak iç retina. Dış retinaya (RPE ve fotoreseptörler) ulaşmada iç limitan membran (ILM) büyük bir engeldir 5)
Bağışıklık tepkisi: Humoral bağışıklık tepkisi güçlü bir şekilde ortaya çıkar. Nötralize edici antikorlar üretilir ve aynı vektörün karşı göze uygulanmasını etkileyebilir
Komplikasyonlar: Endoftalmi, retina dekolmanı (%1’den az)
Subretinal Enjeksiyon
İnvazivlik: En yüksek invaziv. Ameliyathanede pars plana vitrektomi gerektirir
Ulaşılan bölge: Dış retina (RPE ve fotoreseptörler) doğrudan erişim. Voretigen neparvovek bu yolla uygulanır5)
İmmün yanıt: Humoral immün yanıt minimaldir. İntravitreal enjeksiyona göre daha az inflamasyon görülür5)
Komplikasyonlar: Makula deliği, subretinal kanama, fibrozis, retina dekolmanı
Suprakoroidal enjeksiyon, periferik RPE ve koroidi geniş çapta hedefleyebilen nispeten yeni bir yoldur ve makulaya doğrudan müdahaleden kaçınabilir5).
Ameliyathanede retrobulber anestezi (veya genel anestezi) altında yapılır. Göz yüzeyi iyot ile dezenfekte edildikten sonra 23 veya 25 gauge aletlerle pars plana vitrektomi uygulanır. Ardından 41 gauge uç subretinal boşluğa yerleştirilir ve intraoküler irrigasyon sıvısı (BSS) enjeksiyonu ile bir bleb oluşturulur, ardından viral vektör enjekte edilir. İntraoperatif OCT, lokalizasyon ve enjeksiyon doğruluğunu artırmada faydalıdır.
Postoperatif dönemde sıvının arka kutupta kalması için 2-24 saat sırtüstü pozisyon önerilir. Oral prednizon postoperatif 21-61 gün boyunca verilir ve ilk 2 haftadan sonra azaltılır. Takip, görme keskinliği, görme alanı, mikroperimetri, ERG, OCT, fundus fotoğrafı ve otofloresans (AF) değerlendirmesini içerir.
Voretigen Neparvovek (Luxturna), RPE65 genindeki biallelik mutasyonlarla ilişkili IRD için FDA (2017) ve EMA (2018) tarafından onaylanmış bir oküler viral gen tedavisi ürünüdür5). AAV2’ye yerleştirilmiş RPE65 transgenini subretinal enjeksiyonla canlı RPE hücrelerine ulaştırır.
Faz III çalışmasında, görme keskinliği 20/60 veya daha düşük olan 3 yaş ve üzeri 29 hasta katılmış ve çoklu parlaklık hareket testinde (MLMT) fonksiyonel görme iyileşmesi gösterilmiştir (2 hastada hafif inflamasyon görülmüş ancak ciddi komplikasyon olmamıştır).
Uygunluk kriterleri aşağıdaki gibidir:
| Hastalık | Gen | Vektör | Uygulama Yolu |
|---|---|---|---|
| X’e Bağlı Retinoskizis (XLRS) | RS1 | AAV | İntravitreal |
| Stargardt hastalığı | ABCA4 | EIAV (lentivirüs) | Subretinal |
| Koroideremi | CHM (REP1) | AAV2 | Subretinal |
| Retinitis pigmentosa (X’e bağlı) | RPGR | AAV8/AAV9 | Subretinal |
| Tam renk körlüğü | CNGA3/CNGB3 | AAV | Subretinal |
| Neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu | aflibercept | AAV2 | Vitre içi |
| LHON | ND4 | AAV2 | Vitre içi |
Şu anda 30’dan fazla oftalmik gen replasman tedavisi klinik çalışması devam etmektedir.
RPE65 geninde biallelik patojenik mutasyonlara sahip olmak ve tedavi edilebilir canlı retina hücrelerinin kalması, uygunluk kararının ön koşuludur 5). Görme işlevi sıfıra yakın olan tam körlükte etki beklenmediğinden, kalan işlevin doğrulandığı dönemde tedavi önemlidir.
RPE65 (retinoid izomerohidrolaz), RPE hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir enzimdir ve görme döngüsünde all-trans-retinil esterleri 11-cis-retinole dönüştürme rolünü üstlenir. RPE65 eksikliğinde 11-cis-retinal (fotoreseptör hücrelerindeki ışık alıcı pigmentlerin hammaddesi olan A vitamini türevi) yetersiz kalır ve fotoreseptörlerde ışık dönüşümü (fototransdüksiyon) bozulur.
AAV kapsidi beta varil yapısı ve yüzey halkalarından oluşur; yüzey halkaları doku tropizmini belirler5). Uygulama yoluna bağlı olarak kapsidin temas ettiği hücreler farklılık gösterdiğinden, hangi hücrelerin transdüksiyona uğrayacağı uygulama yolu ve kapsid kombinasyonuyla belirlenir.
Serotipe göre RPE ve fotoreseptör tropizmi aşağıdaki gibidir:
Yabancı proteinler ve yabancı DNA, inflamasyon indükleyicileri olarak bilinir ve immün ayrıcalıklı göz içi ortamında bile inflamasyona neden olabilir. İntravitreal uygulamada vektör vitreus boşluğuna yayılır ve humoral immün yanıt oluşmaya yatkındır. Buna karşılık subretinal uygulama, vektörün immün sistemden daha iyi korunmasını sağlar ve inflamatuar yanıt daha azdır5).
Kapsid, spesifik olarak intravitreal inflamasyona neden olur ve genetik materyal, hem ön hem de arka segment inflamasyonunda rol oynar. Boş kapsidlerin de intravitreal enjeksiyon sonrası vitreite neden olduğu doğrulanmıştır.
VN tedavisi sonrası CRA’nın mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır, ancak birden fazla faktörün rol oynadığı düşünülmektedir.
Kolesnikova ve ark. (2022), 11 yaşında VN tedavisi gören ve 19 yaşında koroid-retina atrofisi gelişen bir hastanın 8 yıllık takibini bildirdi4). Tedavi öncesinde otofloresans neredeyse kaybolmuştu, ancak 6 ve 8 yıllık takiplerde parafoveal bölgede otofloresans tespit edildi ve görsel döngünün devam eden işlevini gösterdi. 8 yıl sonra her iki gözde görme keskinliği tedavi öncesi başlangıç değerlerine döndü ve hastalık stabildi.
Merle ve ark. (2025), hafif RPE65-IRD’li 4 çocukta (6-12 yaş) VN tedavisinin kısa dönem sonuçlarını bildirdi3). Tüm vakalarda FST (tam alan uyarı eşiği) iyileşmesi ile çubuk kurtarma etkisi doğrulandı. 3 vakada retina kesi bölgesinde CRA gözlendi, ancak ilerleyici genişleme görülmedi. Erken tedavi ile retina dejenerasyonunun daha az olduğu bir aşamada müdahale edilirse, hızlı genişleyen CRA riskinin azaltılması mümkün olabilir.
Ku ve ark. (2024), önceki VN’den farklı bir AAV vektörü (rAAV2-CB-hRPE65) ile tedavi edilen karşı göze daha sonra VN uygulanan 4 vakayı bildirdi (ilk tedavi 6-11 yaş, VN 12-21 yaş)2). 4 vakanın 3’ünde VN tedavisi gören gözde CRA gelişti (5-22 ay içinde). Tüm vakalarda FST iyileşmesi doğrulanmasına rağmen, CRA insidansı normal %15-75’e kıyasla önemli ölçüde yüksekti. Yazarlar, immün sensitizasyon ve aşırı metabolizmanın kombine bir mekanizmasını öne sürdü. Farklı vektörlerin farklı gözlere uygulanması durumunda dikkatli değerlendirme gereklidir.
Yönlendirilmiş Evrim (Directed Evolution): AAV kapsidinin yapay olarak optimize edilmesiyle, primatların kalın iç limitan membranını geçip dış retina katmanlarına ulaşabilen vektörlerin geliştirilmesi ilerlemektedir5). Bu, intravitreal enjeksiyonla bile dış retinaya gen iletimini mümkün kılabilir.
RdCVF (Çubuk Kaynaklı Koni Sağkalım Faktörü): Konilerin sağkalımını destekleyen bir nöroprotektif strateji olarak araştırılmaktadır5). Birden fazla genetik alt tip için ortak bir tedavi olabilir.
Gen Düzenleme (CRISPR/Cas9): AAV aracılı genom cerrahisi üzerine preklinik çalışmalar ilerlemektedir, özellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve dominant mutasyonlara bağlı hastalıklara uygulanması araştırılmaktadır5).
Suprakoroidal Enjeksiyon: Periferik RPE ve koroidin geniş alan tedavisi için yeni bir yol olarak araştırılmaktadır5).
Birçok raporda, CRA oluşan gözlerde bile görme keskinliğinin (BCVA) korunduğu ve FST iyileşmesinin devam etme eğiliminde olduğu bildirilmiştir4). Ancak CRA foveayı etkilerse görme üzerinde olumsuz etki olabileceğinden endişe edilmektedir. CRA’nın büyüme paterni kişiden kişiye büyük farklılık gösterir ve uzun süreli görüntüleme takibi gereklidir.
