La terapia genica con vettori virali è una tecnica per complementare o riparare geni difettosi. L’occhio possiede tre caratteristiche — privilegio immunitario, barriera emato-retinica e cellule terminalmente differenziate — che lo rendono un organo particolarmente adatto alla terapia genica.
Il privilegio immunitario è un meccanismo con cui l’occhio limita le reazioni infiammatorie per preservare la funzione visiva. Molecole immunomodulatorie sopprimono le cellule infiammatorie e riducono la risposta immunitaria contro il transgene. La barriera emato-retinica limita l’esposizione sistemica ai farmaci, riducendo gli effetti collaterali. La composizione di cellule terminalmente differenziate (fotorecettori e cellule RPE) riduce intrinsecamente il rischio di integrazione cromosomica e mutagenesi inserzionale.
Sono state scoperte oltre 270 mutazioni genetiche responsabili di malattie retiniche ereditarie (IRD), che colpiscono principalmente i fotorecettori o le cellule RPE. Poiché la maggior parte delle IRD sono malattie monogeniche, costituiscono bersagli ideali per la terapia genica sostitutiva.
Nel dicembre 2017, la FDA ha approvato il voretigene neparvovec (nome commerciale: Luxturna), sviluppato da Spark Therapeutics. Anche l’EMA lo ha approvato nel 20185). È il primo prodotto di terapia genica oculare al mondo, mirato alle IRD (LCA2 e retinite pigmentosa) associate a mutazioni bialleliche del gene RPE65.
L’occhio possiede privilegio immunitario, barriera emato-retinica e uno spazio chiuso, consentendo di somministrare efficacemente piccoli volumi di vettore alle cellule bersaglio. Inoltre, la retina è composta da cellule terminalmente differenziate non in divisione, garantendo un’espressione genica stabile e a lungo termine. Questi fattori stanno accelerando la terapia genica in oftalmologia.
I sintomi delle malattie retiniche ereditarie trattabili con terapia genica variano a seconda della malattia, ma i principali sono i seguenti:
Reperti del fundus nella LCA2
Depositi pigmentari a forma di corpuscoli ossei : depositi granulari neri attorno ai vasi retinici e nella media periferia. Reperto classico nella RP.
Restringimento dei vasi retinici : le arterie diventano più sottili con la progressione.
Pallore della papilla ottica : osservato negli stadi avanzati.
Riduzione della FAF : riduzione dell’autofluorescenza dovuta a un disturbo del ciclo visivo. Caratteristico della RPE65-IRD.
Reperti complicati dopo trattamento VN
Atrofia corioretinica (CRA) : riportata nel 13-28% dei casi dopo intervento. Può verificarsi anche al di fuori del sito di retinotomia 2).
Formazione di bolle sottoretiniche : distacco temporaneo dei fotorecettori e dell’EPR dopo iniezione sottoretinica.
Vitrite : reazione infiammatoria che si verifica principalmente all’inizio del trattamento
Cataratta sottocapsulare posteriore : riportata in casi a lungo termine1)
I principali vettori virali utilizzati nella terapia genica oftalmica sono AAV, adenovirus e lentivirus. Le loro caratteristiche sono riportate di seguito5).
| Vettore | Acido nucleico | Capacità | Immunogenicità | Mutagenesi inserzionale |
|---|---|---|---|---|
| AAV | DNA a singolo filamento | ~4,7 kb | Bassa | Bassa (episomiale) |
| Adenovirus | DNA a doppio filamento | Fino a 37 kb | Alta | Bassa (episomiale) |
| Lentivirus | RNA a singolo filamento | 8–10 kb | Media | Sì (integrazione cromosomica) |
L’AAV è un virus a DNA a singolo filamento non rivestito appartenente alla famiglia dei Parvoviridae. È attualmente il vettore più ampiamente utilizzato nella terapia genica retinica5).
I vantaggi dell’AAV sono i seguenti5):
Sono stati identificati 13 sierotipi distinti, di cui AAV2, AAV4, AAV5 e AAV8 sono principalmente utilizzati in oftalmologia. AAV2 infetta con successo la retina interna dal lato vitreale, ma il raggiungimento della retina esterna è limitato. La somministrazione sottoretinica di AAV2 e AAV8 mostra un’introduzione efficace rispettivamente nell’EPR e nei fotorecettori.
Circa il 70% della popolazione generale possiede anticorpi preesistenti contro AAV2 e il 38% possiede anticorpi contro AAV8. Questi anticorpi neutralizzanti sono associati a una ridotta espressione genica, pertanto i vettori basati su AAV8 potrebbero essere più efficaci di quelli basati su AAV2.
La capacità di packaging è limitata a circa 4,7–4,8 kb, quindi non può trattare geni di grandi dimensioni come ABCA4 (malattia di Stargardt) o MYO7A (sindrome di Usher)5).
È un virus a DNA a doppio filamento senza involucro, in grado di trasportare fino a 37 kb di geni. Ha la caratteristica di iniziare l’espressione entro 48 ore dall’iniezione. Tuttavia, provoca una forte risposta immunitaria e sono stati riportati gravi effetti collaterali come febbre, danno epatico, infezione sistemica e morte. Attualmente in oftalmologia viene utilizzato solo in un singolo studio sul retinoblastoma5).
È un retrovirus a RNA a singolo filamento derivato da HIV, virus dell’anemia infettiva equina (EIAV), ecc. Può trasportare geni di 8–10 kb, è efficace per trasdurre le cellule dell’EPR ma non può colpire efficacemente i fotorecettori. A differenza di AAV e adenovirus, integra il DNA complementare nel cromosoma, con rischio di mutagenesi inserzionale5). Vettori EIAV sono utilizzati in studi clinici per la malattia di Stargardt e la sindrome di Usher (USH1B).
Poiché la capacità dell’AAV è limitata a circa 4,7–4,8 kb, le malattie che richiedono la codifica di geni grandi come ABCA4 (malattia di Stargardt), MYO7A (sindrome di Usher) o EYS non possono essere affrontate con l’AAV5). In questo caso, i vettori lentivirali sono un’opzione, ma comportano il rischio di integrazione cromosomica.
Esistono principalmente tre vie di somministrazione per la terapia genica virale oftalmica. Le caratteristiche e le indicazioni di ciascuna via sono riportate di seguito.
Iniezione intravitreale
Invasività: la meno invasiva. Può essere eseguita in regime ambulatoriale in anestesia locale.
Aree raggiunte: principalmente la retina interna. Il raggiungimento della retina esterna (EPR, fotorecettori) è fortemente ostacolato dalla membrana limitante interna (ILM)5).
Reazione immunitaria: la risposta immunitaria umorale è spesso forte. Vengono prodotti anticorpi neutralizzanti, che possono influenzare la somministrazione dello stesso vettore nell’occhio controlaterale.
Complicanze: endoftalmite, distacco di retina (incidenza < 1 %).
Iniezione sottoretinica
Invasività: la più alta. È necessaria una vitrectomia via pars plana in sala operatoria.
Sede di accesso: accesso diretto alla retina esterna (EPR/fotorecettori). Il voretigene neparvovec viene somministrato per questa via 5).
Reazione immunitaria: reazione umorale minima. Minore infiammazione rispetto all’iniezione intravitreale 5).
Complicanze: foro maculare, emorragia sottoretinica, fibrosi, distacco di retina.
La somministrazione sopracoroideale è una via relativamente nuova che può colpire ampiamente l’EPR periferico e la coroide, e potrebbe evitare la manipolazione diretta della macula 5).
Eseguita in sala operatoria in anestesia retrobulbare (o generale). Dopo la disinfezione della superficie oculare con iodio, si esegue una vitrectomia via pars plana con strumenti di calibro 23 o 25. Quindi si posiziona una punta di calibro 41 nello spazio sottoretinico, si forma una bolla mediante iniezione di soluzione di perfusione intraoculare (BSS), e quindi si somministra il vettore virale. L’OCT intraoperatorio è utile per la localizzazione del sito e per migliorare la precisione dell’iniezione.
Nel postoperatorio, si raccomanda la posizione supina per 2-24 ore per trattenere il liquido al polo posteriore. Il prednisone orale viene somministrato per 21-61 giorni dopo l’intervento, con riduzione graduale dopo le prime 2 settimane. Il follow-up include la valutazione dell’acuità visiva, del campo visivo, della microperimetria, dell’ERG, dell’OCT, della fotografia del fondo e dell’autofluorescenza (AF).
Voretigene neparvovec (Luxturna) è un prodotto di terapia genica virale oftalmica approvato dalla FDA (2017) e dall’EMA (2018) per le IRD associate a mutazioni bialleliche del gene RPE655). Utilizza AAV2 con un transgene RPE65, somministrato per via sottoretinica per raggiungere le cellule RPE sopravvissute.
Lo studio di fase III ha coinvolto 29 pazienti di età ≥ 3 anni con acuità visiva ≤ 20/60, mostrando un miglioramento della visione funzionale misurata con il test di mobilità a più luminosità (MLMT) (lieve infiammazione in 2 pazienti, nessuna complicanza grave).
I criteri di idoneità sono i seguenti:
| Malattia | Gene | Vettore | Via di somministrazione |
|---|---|---|---|
| Retinoschisi legata all’X (XLRS) | RS1 | AAV | Intravitreale |
| Malattia di Stargardt | ABCA4 | EIAV (lentivirus) | Sottoretinico |
| Coroidermia | CHM (REP1) | AAV2 | Sottoretinico |
| Retinite pigmentosa (legata all’X) | RPGR | AAV8/AAV9 | Sottoretinico |
| Achromatopsia | CNGA3/CNGB3 | AAV | Sottoretinico |
| Degenerazione maculare neovascolare legata all’età | aflibercept | AAV2 | Intravitreale |
| LHON | ND4 | AAV2 | Intravitreale |
Attualmente sono in corso oltre 30 studi clinici di terapia genica sostitutiva in oftalmologia.
La presenza di mutazioni patogene bialleliche del gene RPE65 e la persistenza di cellule retiniche vitali trattabili sono prerequisiti per l’indicazione 5). Nella cecità completa con funzione visiva quasi nulla l’effetto è improbabile, quindi è importante trattare quando sono ancora presenti funzioni residue.
RPE65 (retinoide isomeroidrolasi) è un enzima altamente espresso nelle cellule dell’EPR, che nel ciclo visivo converte l’estere all-trans-retinilico in 11-cis-retinolo. La carenza di RPE65 porta a una carenza di 11-cis-retinale (un derivato della vitamina A necessario per la formazione dei pigmenti dei fotorecettori), compromettendo la fototrasduzione nei fotorecettori.
Il capside di AAV è formato da una struttura a barile beta e da anse esposte in superficie; le anse superficiali determinano il tropismo tissutale 5). A seconda della via di somministrazione, le cellule con cui il capside entra in contatto sono diverse, quindi quali cellule vengono trasdotte dipende dalla combinazione via di somministrazione/capside.
Il tropismo per RPE e fotorecettori in base al sierotipo è il seguente:
Le proteine estranee e il DNA estraneo sono noti come fattori pro-infiammatori e possono causare infiammazione anche nell’ambiente intraoculare immunoprivilegiato. Con l’iniezione intravitreale, il vettore si diffonde in tutta la cavità vitreale, favorendo una risposta immunitaria umorale. Al contrario, l’iniezione sottoretinica garantisce un migliore mascheramento del vettore dal sistema immunitario, con una minore reazione infiammatoria 5).
Il capside provoca specificamente un’infiammazione intravitreale, mentre il materiale genetico è coinvolto nell’infiammazione sia del segmento anteriore che posteriore. È stato confermato che anche i capsidi vuoti causano vitrite dopo iniezione intravitreale.
Il meccanismo della CRA dopo trattamento VN non è completamente chiarito, ma si ritiene che siano coinvolti molteplici fattori.
Kolesnikova et al. (2022) hanno riportato un follow-up di 8 anni in un paziente trattato con VN all’età di 11 anni e che ha sviluppato atrofia corioretinica all’età di 19 anni4). Prima del trattamento, l’autofluorescenza era quasi assente, ma ai follow-up a 6 e 8 anni è stata rilevata autofluorescenza parafoveale, indicando una funzione continua del ciclo visivo. A 8 anni, l’acuità visiva di entrambi gli occhi era tornata ai valori basali pre-trattamento e la malattia era stabile.
Merle et al. (2025) hanno riportato i risultati a breve termine del trattamento con VN in 4 bambini (6-12 anni) con RPE65-IRD lieve3). In tutti i casi è stato confermato un miglioramento della FST (soglia di stimolazione del campo visivo totale), indicando un effetto di salvataggio dei bastoncelli. In 3 casi è stata osservata CRA nel sito della retinotomia, ma senza espansione progressiva. Un trattamento precoce, quando la degenerazione retinica è minore, potrebbe ridurre il rischio di CRA a rapida espansione.
Ku et al. (2024) hanno riportato 4 casi (trattamento iniziale a 6-11 anni, somministrazione di VN a 12-21 anni) in cui VN è stato somministrato successivamente nell’occhio controlaterale trattato con un vettore AAV diverso (rAAV2-CB-hRPE65)2). In 3 dei 4 casi si è verificata CRA nell’occhio trattato con VN (entro 5-22 mesi). Il miglioramento della FST è stato confermato in tutti i casi, ma l’incidenza di CRA era significativamente più alta (15-75%). Gli autori hanno proposto un meccanismo combinato di immunizzazione e sovraccarico metabolico. La somministrazione di vettori diversi in occhi diversi richiede un’attenta valutazione.
Evoluzione diretta: Ottimizzando artificialmente i capside AAV, si stanno sviluppando vettori in grado di attraversare la spessa membrana limitante interna dei primati e raggiungere la retina esterna5). Ciò potrebbe consentire la consegna genica alla retina esterna anche tramite iniezione intravitreale.
RdCVF (fattore di sopravvivenza dei coni derivato dai bastoncelli): È studiato come strategia neuroprotettiva per promuovere la sopravvivenza dei coni5). Potrebbe rappresentare un trattamento comune per diversi sottotipi genetici.
Editing genetico (CRISPR/Cas9): Sono in corso ricerche precliniche sulla chirurgia genomica mediata da AAV, in particolare per applicazioni nella degenerazione maculare legata all’età e nelle malattie causate da mutazioni dominanti5).
Somministrazione sopracoroideale: Questa nuova via è studiata per consentire un trattamento esteso dell’EPR e della coroide periferici5).
Molti rapporti indicano che anche negli occhi con CRA, l’acuità visiva (BCVA) viene mantenuta e il miglioramento del FST tende a persistere 4). Tuttavia, se la CRA si estende alla fovea, l’impatto sulla vista è preoccupante. Il pattern di crescita della CRA varia notevolmente tra gli individui, richiedendo un monitoraggio di imaging a lungo termine.
