Генная терапия с использованием вирусных векторов — это метод дополнения или исправления дефектных генов. Глаз обладает тремя характеристиками — иммунной привилегией, гематоретинальным барьером и терминально дифференцированными клетками, — что делает его особенно подходящим органом для генной терапии.
Иммунная привилегия — это механизм, с помощью которого глаз ограничивает воспалительные реакции для сохранения зрительной функции. Иммуномодулирующие молекулы подавляют воспалительные клетки и снижают иммунный ответ на трансген. Гематоретинальный барьер ограничивает системное воздействие лекарств, уменьшая побочные эффекты. Состав из терминально дифференцированных клеток (фоторецепторов и клеток RPE) по своей сути снижает риск хромосомной интеграции и инсерционного мутагенеза.
Обнаружено более 270 генных мутаций, вызывающих наследственные заболевания сетчатки (IRD), которые в основном поражают фоторецепторы или клетки RPE. Поскольку большинство IRD являются моногенными заболеваниями, они являются идеальными мишенями для генной заместительной терапии.
В декабре 2017 года FDA одобрило воретиген непарвовек (торговое название: Люкстурна), разработанный Spark Therapeutics. EMA также одобрило его в 2018 году5). Это первый в мире офтальмологический продукт генной терапии, предназначенный для IRD (LCA2 и пигментного ретинита), связанных с биаллельными мутациями гена RPE65.
Глаз обладает иммунной привилегией, гематоретинальным барьером и замкнутым пространством, что позволяет эффективно доставлять небольшие объемы вектора к клеткам-мишеням. Кроме того, сетчатка состоит из неделящихся терминально дифференцированных клеток, что обеспечивает стабильную и долгосрочную экспрессию гена. Эти факторы ускоряют развитие генной терапии в офтальмологии.
Симптомы наследственных заболеваний сетчатки, подлежащих генной терапии, различаются в зависимости от заболевания, но основными являются следующие:
Глазное дно при LCA2
Пигментные отложения в виде костных телец : черные зернистые отложения вокруг сосудов сетчатки и в средней периферии. Классический признак RP.
Сужение сосудов сетчатки : артерии становятся тоньше по мере прогрессирования.
Бледность диска зрительного нерва : наблюдается на поздних стадиях.
Снижение FAF : снижение аутофлуоресценции из-за нарушения зрительного цикла. Характерно для RPE65-IRD.
Осложнения после лечения VN
Хориоретинальная атрофия (ХРА) : сообщается в 13–28% случаев после операции. Может возникать за пределами места ретинотомии 2).
Образование субретинальных пузырей : временное отслоение фоторецепторов и ПЭС после субретинальной инъекции.
Витриит : воспалительная реакция, возникающая в основном на ранних сроках после лечения
Задняя субкапсулярная катаракта : описана при длительном течении1)
Основными вирусными векторами, используемыми в офтальмологической генной терапии, являются AAV, аденовирус и лентивирус. Их характеристики приведены ниже5).
| Вектор | Нуклеиновая кислота | Вместимость | Иммуногенность | Инсерционный мутагенез |
|---|---|---|---|---|
| AAV | Одноцепочечная ДНК | ~4,7 т.п.н. | Низкая | Низкий (эписомный) |
| Аденовирус | Двуцепочечная ДНК | до 37 т.п.н. | Высокая | Низкий (эписомный) |
| Лентивирус | Одноцепочечная РНК | 8–10 т.п.н. | Средняя | Да (хромосомная интеграция) |
AAV — это безоболочечный одноцепочечный ДНК-вирус, принадлежащий к семейству парвовирусов. В настоящее время это наиболее широко используемый вектор в ретинальной генной терапии5).
Преимущества AAV следующие5):
Идентифицировано 13 четких серотипов, из которых AAV2, AAV4, AAV5 и AAV8 в основном используются в офтальмологии. AAV2 успешно инфицирует внутреннюю сетчатку со стороны стекловидного тела, но достижение наружной сетчатки ограничено. Субретинальное введение AAV2 и AAV8 показывает эффективное проникновение в ПЭС и фоторецепторы соответственно.
Примерно 70% общей популяции имеют пресуществующие антитела к AAV2, а 38% — антитела к AAV8. Эти нейтрализующие антитела связаны со снижением экспрессии гена, поэтому векторы на основе AAV8 могут быть более эффективными, чем на основе AAV2.
Упаковочная емкость ограничена примерно 4,7–4,8 т.п.н., поэтому крупные гены, такие как ABCA4 (болезнь Штаргардта) или MYO7A (синдром Ашера), не могут быть обработаны5).
Это безоболочечный двухцепочечный ДНК-вирус, способный нести до 37 т.п.н. генов. Характеризуется быстрым началом экспрессии в течение 48 часов после инъекции. Однако он вызывает сильный иммунный ответ, и сообщалось о серьезных побочных эффектах, таких как лихорадка, повреждение печени, системная инфекция и смерть. В настоящее время в офтальмологии он используется только в одном исследовании ретинобластомы5).
Это одноцепочечный РНК-ретровирус, происходящий от ВИЧ, вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) и др. Он может нести гены размером 8–10 т.п.н., эффективен для трансдукции клеток РПЭ, но не может эффективно нацеливаться на фоторецепторы. В отличие от AAV и аденовируса, он интегрирует комплементарную ДНК в хромосому, что несет риск инсерционного мутагенеза5). Векторы EIAV используются в клинических испытаниях болезни Штаргардта и синдрома Ашера (USH1B).
Поскольку емкость AAV ограничена примерно 4,7–4,8 т.п.н., заболевания, требующие кодирования крупных генов, таких как ABCA4 (болезнь Штаргардта), MYO7A (синдром Ашера) или EYS, не могут быть решены с помощью AAV5). В этом случае лентивирусные векторы являются вариантом, но с риском хромосомной интеграции.
Существует три основных пути введения для офтальмологической вирусной генной терапии. Характеристики и показания каждого пути приведены ниже.
Интравитреальное введение
Инвазивность: наименее инвазивно. Может выполняться амбулаторно под местной анестезией.
Достигаемые области: в основном внутренняя сетчатка. Достижение наружной сетчатки (РПЭ, фоторецепторы) сильно затруднено внутренней пограничной мембраной (ВПМ)5).
Иммунная реакция: гуморальный иммунный ответ часто сильный. Вырабатываются нейтрализующие антитела, которые могут повлиять на введение того же вектора в другой глаз.
Осложнения: эндофтальмит, отслойка сетчатки (частота < 1 %).
Субретинальное введение
Инвазивность: наиболее высокая. Требуется витрэктомия через плоскую часть цилиарного тела в операционной.
Место доступа: прямой доступ к наружным слоям сетчатки (ПЭС/фоторецепторы). Воретиген непарвовек вводится этим путем 5).
Иммунная реакция: минимальный гуморальный иммунный ответ. Меньше воспаления, чем при интравитреальном введении 5).
Осложнения: макулярное отверстие, субретинальное кровоизлияние, фиброз, отслойка сетчатки.
Супрахориоидальное введение — относительно новый путь, который может широко воздействовать на периферический ПЭС и сосудистую оболочку, и может избежать прямого манипулирования макулой 5).
Выполняется в операционной под ретробульбарной (или общей) анестезией. После дезинфекции поверхности глаза йодом проводится витрэктомия через плоскую часть цилиарного тела инструментами 23 или 25 калибра. Затем в субретинальное пространство помещается канюля 41 калибра, с помощью инъекции внутриглазной перфузионной жидкости (BSS) формируется пузырек, после чего вводится вирусный вектор. Интраоперационная ОКТ полезна для локализации места и повышения точности инъекции.
После операции рекомендуется положение на спине в течение 2–24 часов для удержания жидкости в заднем полюсе. Пероральный преднизон назначается на 21–61 день после операции с постепенным снижением после первых 2 недель. Последующее наблюдение включает оценку остроты зрения, поля зрения, микропериметрии, ЭРГ, ОКТ, фотографию глазного дна и аутофлуоресценцию (АФ).
Воретиген непарвовек (Luxturna) — это офтальмологический продукт вирусной генной терапии, одобренный FDA (2017) и EMA (2018) для лечения IRD, связанных с биаллельными мутациями гена RPE655). Он использует AAV2 с трансгеном RPE65, который доставляется к выжившим клеткам RPE путем субретинальной инъекции.
В исследовании III фазы приняли участие 29 пациентов в возрасте от 3 лет с остротой зрения 20/60 или ниже, было показано улучшение функционального зрения по тесту мобильности при множественной яркости (MLMT) (легкое воспаление отмечено у 2 пациентов, без серьезных осложнений).
Критерии отбора следующие:
| Заболевание | Ген | Вектор | Путь введения |
|---|---|---|---|
| Х-сцепленный ретиношизис (XLRS) | RS1 | AAV | Интравитреально |
| Болезнь Штаргардта | ABCA4 | EIAV (лентивирус) | Субретинально |
| Хориоидеремия | CHM (REP1) | AAV2 | Субретинально |
| Пигментный ретинит (X-сцепленный) | RPGR | AAV8/AAV9 | Субретинально |
| Ахроматопсия | CNGA3/CNGB3 | AAV | Субретинально |
| Неоваскулярная возрастная макулярная дегенерация | афлиберцепт | AAV2 | Интравитреально |
| LHON | ND4 | AAV2 | Интравитреально |
В настоящее время проводится более 30 клинических испытаний генной заместительной терапии в офтальмологии.
Наличие биаллельных патогенных мутаций в гене RPE65 и сохранение жизнеспособных клеток сетчатки, поддающихся лечению, являются предпосылками для определения показаний 5). При полной слепоте с почти нулевой зрительной функцией эффект маловероятен, поэтому важно лечение в период, когда еще сохраняются остаточные функции.
RPE65 (ретиноидная изомерогидролаза) — фермент, высоко экспрессируемый в клетках пигментного эпителия сетчатки, который в зрительном цикле превращает all-trans-ретиниловый эфир в 11-cis-ретинол. Дефицит RPE65 приводит к недостатку 11-cis-ретиналя (производного витамина A, необходимого для образования пигментов фоторецепторов), что нарушает фототрансдукцию в фоторецепторах.
Капсид AAV состоит из бета-бочонковой структуры и поверхностных петель; поверхностные петли определяют тканевый тропизм 5). В зависимости от пути введения капсид контактирует с разными клетками, поэтому то, какие клетки трансдуцируются, определяется комбинацией пути введения и капсида.
Тропизм к RPE и фоторецепторам по серотипам следующий:
Чужеродные белки и чужеродная ДНК известны как индукторы воспаления и могут вызывать воспаление даже в иммунопривилегированной внутриглазной среде. При интравитреальном введении вектор распространяется по всей полости стекловидного тела, что способствует гуморальному иммунному ответу. Напротив, субретинальное введение обеспечивает лучшее экранирование вектора от иммунной системы, с меньшей воспалительной реакцией 5).
Капсид специфически вызывает интравитреальное воспаление, тогда как генетический материал участвует в воспалении как переднего, так и заднего отделов глаза. Было подтверждено, что пустые капсиды также вызывают витрит после интравитреального введения.
Механизм CRA после лечения VN полностью не выяснен, но считается, что в нем участвуют несколько факторов.
Kolesnikova и соавт. (2022) сообщили о 8-летнем наблюдении пациента, получившего лечение VN в возрасте 11 лет и развившего хориоретинальную атрофию в возрасте 19 лет4). До лечения аутофлуоресценция почти отсутствовала, но при наблюдении через 6 и 8 лет была обнаружена парафовеальная аутофлуоресценция, указывающая на непрерывную функцию зрительного цикла. Через 8 лет острота зрения обоих глаз вернулась к исходным значениям до лечения, и заболевание было стабильным.
Merle и соавт. (2025) сообщили о краткосрочных результатах лечения VN у 4 детей (6–12 лет) с легкой RPE65-IRD3). Во всех случаях было подтверждено улучшение FST (порог стимуляции полного поля), что указывает на эффект спасения палочек. В 3 случаях наблюдалась CRA в месте ретинотомии, но без прогрессирующего расширения. Раннее лечение, когда дегенерация сетчатки менее выражена, может снизить риск быстро расширяющейся CRA.
Ku и соавт. (2024) сообщили о 4 случаях (первичное лечение в возрасте 6–11 лет, введение VN в возрасте 12–21 лет), когда VN вводили позже в контралатеральный глаз, ранее леченный другим AAV-вектором (rAAV2-CB-hRPE65)2). У 3 из 4 случаев развилась CRA в глазу, леченном VN (в течение 5–22 месяцев). Улучшение FST было подтверждено во всех случаях, но частота CRA была значительно выше обычной (15–75%). Авторы предположили комбинированный механизм иммунизации и метаболической перегрузки. Введение разных векторов в разные глаза требует тщательного рассмотрения.
Направленная эволюция: Путем искусственной оптимизации капсидов AAV разрабатываются векторы, способные проникать через толстую внутреннюю пограничную мембрану приматов и достигать наружной сетчатки5). Это может обеспечить доставку генов в наружную сетчатку даже при интравитреальном введении.
RdCVF (фактор выживания колбочек, производный от палочек): Изучается как нейропротекторная стратегия для стимулирования выживания колбочек5). Он может стать общим лечением для нескольких генетических подтипов.
Редактирование генов (CRISPR/Cas9): Проводятся доклинические исследования AAV-опосредованной геномной хирургии, особенно для применения при возрастной макулярной дегенерации и заболеваниях, вызванных доминантными мутациями5).
Супрахориоидальное введение: Изучается как новый путь, позволяющий проводить обширное лечение периферического РПЭ и хориоидеи5).
Многие сообщения показывают, что даже в глазах с CRA острота зрения (BCVA) сохраняется, а улучшение FST имеет тенденцию сохраняться 4). Однако если CRA распространяется на фовеа, существует опасение по поводу влияния на зрение. Характер роста CRA сильно варьируется у разных людей, что требует долгосрочного мониторинга с помощью визуализации.
