LCA2的眼底所见
眼科基因治疗用病毒载体
一目了然的要点
Section titled “一目了然的要点”1. 什么是基因治疗用病毒载体？
Section titled “1. 什么是基因治疗用病毒载体？”使用病毒载体的基因治疗是一种补充或修复功能失调基因的技术。眼睛具有免疫特权、血-视网膜屏障和终末分化细胞三个特性，使其特别适合基因治疗。
免疫特权是指眼睛为维持视觉功能而限制炎症反应的机制。免疫调节分子抑制炎症细胞，减少对转基因的免疫反应。血-视网膜屏障限制药物的全身暴露，降低副作用。由于眼睛由终末分化细胞（感光细胞和RPE细胞）组成，基因染色体整合和插入突变的风险本质上较低。
已发现超过270种导致遗传性视网膜疾病（IRD）的基因突变，主要影响感光细胞或RPE细胞。由于许多IRD是单基因疾病，因此是基因替代疗法的理想靶点。
2017年12月，FDA批准了Spark Therapeutics开发的voretigene neparvovec（商品名：Luxturna）。EMA也于2018年批准了该药5)。这是全球首个针对RPE65基因双等位基因突变相关IRD（LCA2和视网膜色素变性）的眼科基因治疗产品。
Q
为什么眼睛的基因治疗比其他器官更先进？
A
眼睛具有免疫特权、血-视网膜屏障和封闭空间等特性，少量载体即可有效到达靶细胞。此外，视网膜由非分裂的终末分化细胞组成，因此基因可以稳定长期表达。这些因素加速了眼科领域的基因治疗。
2. 主要症状和临床所见
Section titled “2. 主要症状和临床所见”基因治疗所针对的遗传性视网膜疾病，其症状因疾病而异，主要症状如下。
- 夜盲（暗处视力下降）：由RPE65功能下降导致11-顺式视黄醛不足引起。在LCA2中，这是早期最常见的症状。
- 视力下降：在RPE65-IRD中，从婴幼儿期即出现严重视力下降。即使轻症病例，成年后也会进展。
- 视野狭窄：从周边视野进展的环形暗点是其特征。
- 眼球震颤：在LCA2重症病例中，出生后早期即可观察到。
VN治疗后的合并所见
脉络膜视网膜萎缩（CRA）：术后13-28%的病例报告。也可能发生在视网膜切开部位之外 2)。
视网膜下泡形成：视网膜下注射后，光感受器和RPE暂时脱离的状态。
玻璃体炎：主要发生在治疗早期的炎症反应。
后囊下白内障：长期病例中有报道1)。
3. 病毒载体的类型和特性
Section titled “3. 病毒载体的类型和特性”眼科基因治疗中使用的主要病毒载体有AAV、腺病毒和慢病毒三种。它们的特性如下所示5)。
| 载体 | 核酸 | 容量 | 免疫原性 | 插入突变 |
|---|---|---|---|---|
| AAV | 单链DNA | 约4.7 kb | 低 | 低（游离体） |
| 腺病毒 | 双链DNA | 最大37 kb | 高 | 低（游离体） |
| 慢病毒 | 单链RNA | 8～10 kb | 中 | 有（染色体整合） |
腺相关病毒（AAV）
Section titled “腺相关病毒（AAV）”AAV属于细小病毒科，是一种无包膜的单链DNA病毒。目前是视网膜基因治疗中最广泛使用的载体5)。
AAV的优点如下5)：
- 非致病性：不会引起人类疾病
- 低插入突变风险：基因组以游离体形式存在
- 复制缺陷：无辅助病毒时不能复制
- 转导多种非分裂神经细胞：可感染视杆细胞、视锥细胞和RPE
- 单次给药后持续表达：在非分裂细胞中长时间稳定表达
已确认13种明确的血清型，其中AAV2、AAV4、AAV5和AAV8主要用于眼科。AAV2可从玻璃体侧成功感染内层视网膜，但到达外层视网膜的能力有限。AAV2和AAV8的视网膜下给药分别显示对RPE和感光细胞的有效转导。
一般人群中约70%拥有针对AAV2的预存抗体，38%拥有针对AAV8的抗体。这些中和抗体与基因表达降低相关，因此基于AAV8的载体可能比AAV2更有效。
包装容量限制在约4.7–4.8 kb，无法容纳ABCA4（斯塔加特病）和MYO7A（亚瑟综合征）等大基因5)。
腺病毒（AV）
Section titled “腺病毒（AV）”腺病毒是无包膜的双链DNA病毒，可携带高达37 kb的基因。注射后48小时内开始表达，具有快速的特点。然而，它们会引起强烈的免疫反应，已有发热、肝损伤、全身感染和死亡等严重副作用的报道。因此，目前在眼科仅用于一项视网膜母细胞瘤研究试验5)。
慢病毒是源自HIV、马传染性贫血病毒（EIAV）等的单链RNA逆转录病毒。可携带8–10 kb的基因，能有效转导RPE细胞，但不能有效靶向感光细胞。与AAV和腺病毒不同，它们将互补DNA整合到染色体中，存在插入突变的风险5)。EIAV载体已用于斯塔加特病和亚瑟综合征（USH1B）的临床试验。
Q
AAV包装容量的限制会影响什么？
A
由于AAV的容量限制在约4.7–4.8 kb，因此需要编码超过此大小的大基因的疾病，如ABCA4（斯塔加特病）、MYO7A（亚瑟综合征）和EYS，无法用AAV解决5)。在这种情况下，慢病毒载体成为一种选择，但存在染色体整合的风险。
4. 给药方法
Section titled “4. 给药方法”眼科病毒基因治疗的给药途径主要有三种。各途径的特点和适应症如下所示。
玻璃体内注射
视网膜下注射
脉络膜上腔给药是一种相对较新的途径，可广泛靶向周边RPE和脉络膜，可能避免直接操作黄斑部5)。
视网膜下给药的手术技术
Section titled “视网膜下给药的手术技术”在手术室球后麻醉（或全身麻醉）下进行。用碘消毒眼表面后，使用23或25G器械进行睫状体平坦部玻璃体切除术。然后将41G针头置于视网膜下腔，注入眼内灌注液（BSS）形成水泡，再给予病毒载体。术中OCT有助于定位和提高注射精度。
术后患者需仰卧2-24小时以保持液体在后极部。口服泼尼松21-61天，前2周后逐渐减量。随访包括视力、视野、微视野计、ERG、OCT、眼底照相和自发荧光（AF）评估。
5. 已批准的治疗方法和主要临床应用
Section titled “5. 已批准的治疗方法和主要临床应用”已批准的治疗
Section titled “已批准的治疗”**沃雷替基因内帕尔沃韦克（Luxturna）**是一种眼科病毒基因治疗产品，已获得FDA（2017年）和EMA（2018年）批准，用于治疗与RPE65基因双等位基因突变相关的IRD5)。它将RPE65转基因整合到AAV2中，通过视网膜下注射递送至存活的RPE细胞。
在III期试验中，29名视力为20/60或更差的3岁及以上患者参与，多亮度移动测试（MLMT）显示功能性视力改善（2名患者出现轻度炎症，但无严重并发症）。
资格标准如下：
- 确认RPE65基因的双等位基因致病性突变
- 3岁及以上
- 视力20/60或更差，或视野小于20°
- 存在足够的存活视网膜细胞
开发中/临床试验阶段的主要疾病
Section titled “开发中/临床试验阶段的主要疾病”| 疾病 | 基因 | 载体 | 给药途径 |
|---|---|---|---|
| X连锁视网膜劈裂症（XLRS） | RS1 | AAV | 玻璃体内注射 |
| 斯塔加特病 | ABCA4 | EIAV（慢病毒） | 视网膜下 |
| 无脉络膜症 | CHM（REP1） | AAV2 | 视网膜下 |
| 视网膜色素变性（X连锁） | RPGR | AAV8/AAV9 | 视网膜下 |
| 全色盲 | CNGA3/CNGB3 | AAV | 视网膜下 |
| 新生血管性年龄相关性黄斑变性 | 阿柏西普 | AAV2 | 玻璃体内 |
| LHON | ND4 | AAV2 | 玻璃体内 |
目前有30多项眼科基因替代疗法的临床试验正在进行中。
Q
哪些患者可以接受Luxturna（voretigene neparvovec）治疗？
A
适应症的前提是患者携带RPE65基因的双等位基因致病性突变，并且存在可治疗的存活视网膜细胞5)。对于视功能接近零的完全失明患者，效果可能不佳，因此在确认残留功能时进行治疗至关重要。
6. 病理生理学与详细发病机制
Section titled “6. 病理生理学与详细发病机制”RPE65与视觉循环
Section titled “RPE65与视觉循环”RPE65（视黄醇异构水解酶）是一种在RPE细胞中高表达的酶，在视觉循环中负责将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇。RPE65缺乏会导致11-顺式视黄醛（光感受器细胞中光色素的前体，一种维生素A衍生物）不足，从而损害光感受器中的光转导。
AAV的导入机制
Section titled “AAV的导入机制”AAV衣壳由β-桶状结构和表面暴露的环组成，表面环决定组织趋向性5)。由于给药途径不同，衣壳接触的细胞也不同，因此哪些细胞被转导取决于给药途径和衣壳的组合。
不同血清型的RPE和感光细胞趋向性如下：
- RPE优先：AAV1、AAV4、AAV6
- 感光细胞优先：AAV5、AAV8
- 视网膜神经节细胞（玻璃体内注射）：AAV2（野生型）
基因治疗相关葡萄膜炎（GTAU）的机制
Section titled “基因治疗相关葡萄膜炎（GTAU）的机制”外源蛋白和外源DNA是已知的炎症诱导因子，即使在具有免疫豁免的眼内环境中也可能引起炎症。玻璃体内注射时，载体扩散到整个玻璃体腔，容易发生体液免疫反应。相比之下，视网膜下注射能更好地屏蔽免疫系统对载体的识别，炎症反应较少5)。
衣壳特异性引起玻璃体内炎症，而遗传物质参与眼前段和后段的炎症。已证实空衣壳在玻璃体内注射后也会引起玻璃体炎。
脉络膜视网膜萎缩（CRA）的发生机制
Section titled “脉络膜视网膜萎缩（CRA）的发生机制”VN治疗后CRA的机制尚未完全阐明，但认为涉及多种因素。
- 代谢过载假说：感光细胞拯救后，RPE65功能亢进导致退行性变的感光细胞代谢急剧增加，引起细胞损伤2,3)。CRA最初发生在视野改善最显著的区域，这一发现支持该假说。
- 免疫反应：既往治疗中使用不同载体的患者可能产生免疫致敏，从而增加CRA的发生率2)。
- 手术因素：高注射压力、注射速度和机械性创伤可能参与其中。
7. 最新研究与未来展望（研究阶段报告）
Section titled “7. 最新研究与未来展望（研究阶段报告）”Voretigene Neparvovec的长期安全性
Section titled “Voretigene Neparvovec的长期安全性”Kolesnikova等人（2022）报告了一名患者在11岁时接受VN治疗，19岁时出现脉络膜视网膜萎缩的8年随访结果4)。治疗前自发荧光几乎消失，但在6年和8年的随访中，在中心凹旁检测到自发荧光，表明视觉周期持续功能。8年后，双眼视力恢复到治疗前的基线水平，病情稳定。
Merle等人（2025）报告了4名轻度RPE65-IRD儿童（6-12岁）接受VN治疗的短期结果3)。所有病例均通过全视野刺激阈值（FST）改善证实了视杆细胞拯救效果。3例在视网膜切开部位出现脉络膜视网膜萎缩，但未观察到进行性扩大。早期在视网膜变性较少的阶段进行干预可能降低快速扩张型脉络膜视网膜萎缩的风险。
不同载体间的交叉反应
Section titled “不同载体间的交叉反应”Ku等人（2024）报告了4例病例（初次治疗年龄6-11岁，VN给药年龄12-21岁），这些病例先前用不同的AAV载体（rAAV2-CB-hRPE65）治疗了对侧眼，随后给予VN2)。4例中有3例在VN治疗眼出现脉络膜视网膜萎缩（发病时间5-22个月）。尽管所有病例均确认FST改善，但脉络膜视网膜萎缩的发生率显著高于通常的15-75%。作者提出了免疫致敏和代谢过度的复合机制。当对不同眼睛使用不同载体时，需要仔细考虑。
下一代载体开发
Section titled “下一代载体开发”定向进化：通过人工优化AAV衣壳，开发能够穿过灵长类动物厚内界膜并到达外层视网膜的载体的研究正在进展中5)。这可能使玻璃体内注射也能实现对外层视网膜的基因递送。
RdCVF（视杆细胞来源的视锥细胞存活因子）：作为一种促进视锥细胞存活的神经保护策略正在被研究5)。它可能成为多种遗传亚型的共同治疗方法。
基因编辑（CRISPR/Cas9）：AAV介导的基因组手术的临床前研究正在推进，特别是在年龄相关性黄斑变性和显性突变引起的疾病中的应用正在被探讨5)。
脉络膜上腔给药：作为一种可能实现周边RPE和脉络膜广泛治疗的新途径，研究正在进展中5)。
Q
如果治疗后出现脉络膜视网膜萎缩，视力会怎样？
A
许多报告显示，即使发生CRA的眼睛，视力（BCVA）也能维持，FST改善也倾向于持续4)。但若CRA累及中心凹，则可能影响视力。CRA的生长模式个体差异很大，需要长期影像学监测。
8. 参考文献
Section titled “8. 参考文献”- Lidder AK, Choi S, Modi YS, Brodie SE, Davis JL, Gregori NZ, Lam BL. Bilateral exudative retinal detachments after subretinal gene therapy with voretigene neparvovec-rzyl for RPE65 Leber Congenital Amaurosis. Am J Ophthalmol Case Rep. 2023;32:101879.
- Ku CA, Igelman AD, Huang SJ, Bailey ST, Lauer AK, Duncan JL, Weleber RG, Yang P, Pennesi ME. Perimacular atrophy following voretigene neparvovec-rzyl treatment in the setting of previous contralateral eye treatment with a different viral vector. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(6):11.
- Merle DA, Hertens L, Dimopoulos S, et al. Short-term outcomes of pediatric patients with mild autosomal recessive RPE65-associated retinal dystrophy treated with voretigene neparvovec. Transl Vis Sci Technol. 2025;14(8):8.
- Kolesnikova M, Lima de Carvalho JR Jr, Parmann R, Kim AH, Mahajan VB, Tsang SH, Sparrow JR. Chorioretinal atrophy following voretigene neparvovec despite the presence of fundus autofluorescence. Mol Genet Genomic Med. 2022;10:e2038.
- Botto C, Rucli M, Bucher K, et al. Early and late stage gene therapy interventions for inherited retinal degenerations. Prog Retin Eye Res. 2022;86:100975.