ژن درمانی با استفاده از ناقلهای ویروسی، تکنیکی برای تکمیل یا ترمیم ژنهای ناکارآمد است. چشم به دلیل سه ویژگی: امتیاز ایمنی (immune privilege)، سد خونی-شبکیه و سلولهای تمایز یافته نهایی، اندامی بسیار مناسب برای ژن درمانی محسوب میشود.
امتیاز ایمنی به مکانیسمی گفته میشود که چشم برای حفظ عملکرد بینایی، پاسخ التهابی را محدود میکند. مولکولهای تنظیمکننده ایمنی، سلولهای التهابی را سرکوب کرده و پاسخ ایمنی به ژن منتقل شده را کاهش میدهند. سد خونی-شبکیه قرار گرفتن سیستمیک دارو را محدود کرده و عوارض جانبی را کاهش میدهد. سلولهای تمایز یافته نهایی (سلولهای بینایی و سلولهای اپیتلیوم رنگدانه شبکیه) خطر ادغام کروموزومی و جهشزایی درج را ذاتاً کاهش میدهند.
بیش از ۲۷۰ جهش ژنی مرتبط با بیماریهای ارثی شبکیه (IRD) کشف شده است که عمدتاً در سلولهای بینایی یا سلولهای RPE ظاهر میشوند. بسیاری از IRDها تک ژنی هستند، بنابراین هدف مناسبی برای ژن درمانی جایگزینی محسوب میشوند.
در دسامبر ۲۰۱۷، FDA وورتایژن نپارووک (voretigene neparvovec، با نام تجاری Luxturna) ساخته شده توسط Spark Therapeutics را تأیید کرد. EMA نیز در سال ۲۰۱۸ آن را تأیید کرد5). این اولین محصول ژن درمانی چشمی در جهان است که برای IRD مرتبط با جهشهای دو آللی ژن RPE65 (LCA2 و رتینیت پیگمنتوزا) هدفگیری شده است.
چشم دارای ویژگیهای امتیاز ایمنی، سد خونی-شبکیه و فضای بسته است که امکان رساندن مقدار کمی ناقل به سلولهای هدف را به طور مؤثر فراهم میکند. همچنین شبکیه از سلولهای تمایز یافته نهایی غیرقابل تقسیم تشکیل شده است، بنابراین ژن به طور پایدار و طولانی مدت بیان میشود. این عوامل ژن درمانی در چشم را تسریع کردهاند.
بیماریهای ارثی شبکیه که تحت ژن درمانی قرار میگیرند، علائم متفاوتی دارند، اما علائم اصلی به شرح زیر است:
یافتههای فوندوس در LCA2
رسوبات رنگدانهای استخوانی شکل: رسوبات دانهای سیاه در اطراف عروق شبکیه و ناحیه میانی محیطی. یافته کلاسیک در RP.
باریک شدن عروق شبکیه: با پیشرفت بیماری، شریانها نازکتر میشوند.
رنگ پریدگی دیسک بینایی: در مراحل پیشرفته مشاهده میشود.
کاهش FAF: به دلیل اختلال در چرخه بینایی، فلورسانس خودبهخودی کاهش مییابد. مشخصه RPE65-IRD.
یافتههای همراه پس از درمان VN
آتروفی کوریورتینال (CRA): در 13-28٪ موارد پس از جراحی گزارش شده است. ممکن است خارج از محل برش شبکیه نیز رخ دهد2).
تشکیل بلب زیر شبکیه: وضعیت موقتی جداشدگی سلولهای گیرنده نور و RPE پس از تزریق زیر شبکیه.
ویتریت: واکنش التهابی که عمدتاً در مراحل اولیه پس از درمان رخ میدهد
آب مروارید زیرکپسولی خلفی: در موارد طولانیمدت گزارش شده است1)
ناقلهای ویروسی اصلی مورد استفاده در ژندرمانی چشم عبارتند از AAV، آدنوویروس و لنتیویروس. ویژگیهای هر یک در زیر آورده شده است5).
| ناقل | نوکلئیک اسید | ظرفیت | ایمنیزایی | جهشزایی درجی |
|---|---|---|---|---|
| AAV | DNA تکرشتهای | حدود 4.7 کیلوباز | کم | کم (اپیزومی) |
| آدنوویروس | DNA دو رشتهای | حداکثر 37 کیلوباز | زیاد | کم (اپیزومی) |
| لنتیویروس | RNA تکرشتهای | ۸ تا ۱۰ کیلوباز | متوسط | بله (ادغام کروموزومی) |
AAV یک ویروس DNA تکرشتهای بدون پوشش از خانواده پاروویروسها است. در حال حاضر، این رایجترین ناقل مورد استفاده در ژندرمانی شبکیه است5).
مزایای AAV به شرح زیر است5):
۱۳ سروتیپ مشخص شناسایی شده است که AAV2، AAV4، AAV5 و AAV8 عمدتاً در چشمپزشکی استفاده میشوند. AAV2 از سمت زجاجیه به لایههای داخلی شبکیه نفوذ میکند، اما دسترسی به لایههای خارجی محدود است. تزریق زیرشبکیهای AAV2 و AAV8 به ترتیب انتقال مؤثر به RPE و سلولهای بینایی را نشان میدهد.
حدود ۷۰٪ از جمعیت عمومی آنتیبادیهای از پیش موجود علیه AAV2 و ۳۸٪ علیه AAV8 دارند. این آنتیبادیهای خنثیکننده با کاهش بیان ژن مرتبط هستند، بنابراین ناقلهای مبتنی بر AAV8 ممکن است مؤثرتر از AAV2 باشند.
ظرفیت بستهبندی حدود 4.7 تا 4.8 کیلوباز محدود است و نمیتواند ژنهای بزرگ مانند ABCA4 (بیماری اشتارگارت) یا MYO7A (سندرم آشر) را حمل کند 5).
یک ویروس DNA دو رشتهای بدون پوشش است که میتواند تا 37 کیلوباز ژن را حمل کند. ویژگی سریعی دارد که بیان ژن در عرض 48 ساعت پس از تزریق آغاز میشود. با این حال، واکنش ایمنی قوی ایجاد میکند و عوارض جانبی جدی مانند تب، آسیب کبدی، عفونت سیستمیک و مرگ گزارش شده است، بنابراین در حال حاضر در چشمپزشکی فقط در یک مطالعه تحقیقاتی رتینوبلاستوما استفاده میشود 5).
یک رتروویروس RNA تک رشتهای مشتق از HIV، ویروس کمخونی عفونی اسب (EIAV) و غیره است. میتواند 8 تا 10 کیلوباز ژن را حمل کند و برای انتقال به سلولهای RPE مؤثر است اما نمیتواند سلولهای بینایی را به طور مؤثر هدف قرار دهد. برخلاف AAV و آدنوویروس، DNA مکمل را در کروموزوم ادغام میکند که خطر جهشزایی درجی دارد 5). در کارآزماییهای بالینی بیماری اشتارگارت و سندرم آشر (USH1B) از ناقل EIAV استفاده شده است.
ظرفیت AAV به حدود 4.7 تا 4.8 کیلوباز محدود است، بنابراین بیماریهایی که نیاز به کدگذاری ژنهای بزرگتر مانند ABCA4 (بیماری اشتارگارت)، MYO7A (سندرم آشر) و EYS دارند، با AAV قابل درمان نیستند 5). در این موارد ناقل لنتیویروس گزینهای است، اما خطر ادغام کروموزومی همراه دارد.
سه مسیر اصلی برای تجویز ژندرمانی ویروسی چشمی وجود دارد. ویژگیها و موارد کاربرد هر مسیر در زیر آورده شده است.
تزریق داخل زجاجیهای
تهاجمی بودن: کمترین تهاجم. قابل انجام به صورت سرپایی با بیحسی موضعی
ناحیه هدف: عمدتاً شبکیه داخلی. غشای محدود کننده داخلی (ILM) مانع بزرگی برای رسیدن به شبکیه خارجی (RPE و سلولهای بینایی) است 5)
واکنش ایمنی: واکنش ایمنی هومورال به شدت بروز میکند. آنتیبادیهای خنثیکننده تولید میشوند که ممکن است بر تزریق همان ناقل به چشم مقابل تأثیر بگذارد
عوارض: اندوفتالمیت، جداشدگی شبکیه (شیوع کمتر از 1%)
تزریق زیر شبکیهای
تهاجمی بودن: بسیار تهاجمی. نیاز به ویترکتومی از طریق پارس پلانا در اتاق عمل دارد
محل دسترسی: دسترسی مستقیم به لایههای خارجی شبکیه (RPE و سلولهای بینایی). وورتیژن نپاروووک از این مسیر تجویز میشود5)
واکنش ایمنی: واکنش ایمنی هومورال حداقل است. التهاب کمتر از تزریق داخل زجاجیهای است5)
عوارض: سوراخ ماکولا، خونریزی زیر شبکیه، فیبروز، جداشدگی شبکیه
تزریق سوپراکروئیدال (suprachoroidal) مسیر نسبتاً جدیدی است که میتواند RPE محیطی و مشیمیه را به طور گسترده هدف قرار دهد و از دستکاری مستقیم ماکولا اجتناب کند5).
در اتاق عمل تحت بیحسی رتروبولبار (یا بیهوشی عمومی) انجام میشود. پس از ضدعفونی سطح چشم با ید، ویترکتومی پارس پلانا با ابزار 23 یا 25 گیج انجام میشود. سپس نوک 41 گیج در فضای زیر شبکیه قرار داده شده و با تزریق مایع شستشوی داخل چشمی (BSS) یک تاول ایجاد میشود و سپس وکتور ویروسی تزریق میگردد. OCT حین عمل برای تعیین محل و بهبود دقت تزریق مفید است.
پس از عمل، بیمار به مدت 2 تا 24 ساعت در وضعیت طاقباز قرار میگیرد تا مایع در قطب خلفی باقی بماند. پردنیزولون خوراکی به مدت 21 تا 61 روز پس از عمل تجویز میشود و پس از دو هفته اول کاهش مییابد. پیگیری شامل ارزیابی حدت بینایی، میدان بینایی، میکروپریمتری، ERG، OCT، عکس فوندوس و خودفلورسانس (AF) است.
وورتایژن نپارووک (Luxturna) یک محصول ژن درمانی ویروسی چشمی است که توسط FDA (2017) و EMA (2018) برای IRD مرتبط با جهشهای دو آللی در ژن RPE65 تأیید شده است5). این محصول ترانسژن RPE65 را در AAV2 جاسازی کرده و از طریق تزریق زیر شبکیه به سلولهای RPE زنده میرساند.
در کارآزمایی فاز III، 29 بیمار 3 ساله و بالاتر با حدت بینایی 20/60 یا کمتر شرکت کردند و بهبود عملکرد بینایی در تست تحرک با روشنایی چندگانه (MLMT) نشان داده شد (التهاب خفیف در 2 بیمار مشاهده شد اما عارضه جدی نداشت).
معیارهای واجد شرایط بودن به شرح زیر است:
| بیماری | ژن | ناقل | مسیر تجویز |
|---|---|---|---|
| جداشدگی شبکیه وابسته به X (XLRS) | RS1 | AAV | داخل زجاجیهای |
| بیماری اشتارگارت | ABCA4 | EIAV (لنتیویروس) | زیر شبکیه |
| کوریوادرما | CHM (REP1) | AAV2 | زیر شبکیه |
| رتینیت پیگمنتوزا (وابسته به X) | RPGR | AAV8/AAV9 | زیر شبکیه |
| کوررنگی کامل | CNGA3/CNGB3 | AAV | زیر شبکیه |
| دژنراسیون ماکولای وابسته به سن از نوع نئوواسکولار | aflibercept | AAV2 | داخل زجاجیهای |
| LHON | ND4 | AAV2 | داخل زجاجیهای |
در حال حاضر بیش از ۳۰ کارآزمایی بالینی ژن درمانی جایگزینی برای بیماریهای چشمی در حال انجام است.
داشتن جهشهای بیماریزای دو آللی (biallelic) در ژن RPE65 و باقی ماندن سلولهای شبکیه قابل درمان، پیشنیاز تصمیمگیری برای درمان است 5). در نابینایی کامل که عملکرد بینایی نزدیک به صفر است، اثربخشی مورد انتظار نیست، بنابراین درمان در زمانی که عملکرد باقیمانده تأیید میشود اهمیت دارد.
RPE65 (رتینوئید ایزومروهیدرولاز) آنزیمی است که در سلولهای RPE به میزان زیادی بیان میشود و در چرخه بینایی، استرهای all-trans-رتینیل را به 11-cis-رتینول تبدیل میکند. کمبود RPE65 منجر به کمبود 11-cis-رتینال (مشتق ویتامین A که ماده اولیه رنگدانههای گیرنده نور در سلولهای بینایی است) میشود و در نتیجه تبدیل نور (phototransduction) در گیرندههای نوری مختل میگردد.
کپسید AAV از ساختار بشکه بتا و حلقههای سطحی تشکیل شده است و حلقههای سطحی تمایل بافتی (tropism) را تعیین میکنند5). از آنجایی که سلولهایی که کپسید با آنها تماس پیدا میکند بسته به مسیر تجویز متفاوت است، اینکه کدام سلولها ترانسداکشن میشوند به ترکیب مسیر تجویز و کپسید بستگی دارد.
تمایل به RPE و سلولهای بینایی بر اساس سروتیپ به شرح زیر است:
پروتئینهای خارجی و DNA خارجی به عنوان عوامل القاکننده التهاب شناخته میشوند و حتی در محیط داخل چشمی با ایمنی ممتاز نیز میتوانند باعث التهاب شوند. در تزریق داخل زجاجیهای، وکتور در سراسر حفره زجاجیه پخش میشود و واکنش ایمنی هومورال به راحتی رخ میدهد. در مقابل، تزریق زیر شبکیهای محافظت بهتری از وکتور در برابر سیستم ایمنی ایجاد میکند و واکنش التهابی کمتری دارد5).
کپسید به طور خاص باعث التهاب داخل زجاجیهای میشود و ماده ژنتیکی در التهاب هر دو بخش قدامی و خلفی چشم نقش دارد. تأیید شده است که کپسیدهای خالی نیز پس از تزریق داخل زجاجیهای باعث زجاجیهالتهاب میشوند.
مکانیسم CRA پس از درمان VN به طور کامل شناخته نشده است، اما تصور میشود عوامل متعددی در آن نقش دارند.
Kolesnikova و همکاران (2022) پیگیری 8 ساله یک بیمار را گزارش کردند که در 11 سالگی تحت درمان VN قرار گرفت و در 19 سالگی دچار آتروفی مشیمیه-شبکیه شد4). قبل از درمان، فلورسانس خودبهخودی تقریباً از بین رفته بود، اما در پیگیریهای 6 و 8 ساله، فلورسانس خودبهخودی در ناحیه پارافووهآل تشخیص داده شد که نشاندهنده عملکرد مداوم چرخه بینایی است. پس از 8 سال، حدت بینایی در هر دو چشم به مقادیر پایه قبل از درمان بازگشت و بیماری پایدار بود.
Merle و همکاران (2025) پیامدهای کوتاهمدت درمان VN را در 4 کودک (6 تا 12 سال) مبتلا به RPE65-IRD خفیف گزارش کردند3). در همه موارد، بهبود FST (آستانه محرک میدان کامل) تأیید شد که نشاندهنده نجات عملکرد میلهها است. در 3 مورد، CRA در محل برش شبکیه مشاهده شد، اما گسترش پیشروندهای نداشت. اگر مداخله زودهنگام در مرحلهای که دژنراسیون شبکیه کمتر است انجام شود، ممکن است خطر CRA با گسترش سریع کاهش یابد.
Ku و همکاران (2024) 4 مورد را گزارش کردند که در آنها ابتدا یک چشم با ناقل AAV متفاوت (rAAV2-CB-hRPE65) نسبت به VN قبلی درمان شد و سپس چشم مقابل بعداً VN دریافت کرد (درمان اولیه در 6-11 سالگی، VN در 12-21 سالگی)2). در 3 مورد از 4 مورد، CRA در چشم تحت درمان با VN رخ داد (5 تا 22 ماه پس از درمان). اگرچه بهبود FST در همه موارد تأیید شد، میزان بروز CRA به طور قابل توجهی بالاتر از 15-75٪ معمول بود. نویسندگان مکانیسم ترکیبی ایمنسازی و متابولیسم بیش از حد را پیشنهاد کردند. در صورت تجویز ناقلهای مختلف در چشمهای مختلف، بررسی دقیق ضروری است.
تکامل هدایتشده (Directed Evolution): با بهینهسازی مصنوعی کپسید AAV، توسعه ناقلهایی که میتوانند از غشای محدود کننده داخلی ضخیم نخستیها عبور کرده و به لایههای خارجی شبکیه برسند، در حال پیشرفت است5). این امر میتواند تحویل ژن به لایههای خارجی شبکیه را حتی با تزریق داخل زجاجیهای ممکن سازد.
RdCVF (عامل بقای مخروطی مشتق از میله): به عنوان یک استراتژی محافظت عصبی برای ترویج بقای مخروطها در حال بررسی است5). این میتواند یک درمان مشترک برای زیرگروههای ژنتیکی متعدد باشد.
ویرایش ژن (CRISPR/Cas9): تحقیقات پیش بالینی در مورد جراحی ژنوم با واسطه AAV در حال پیشرفت است، به ویژه برای کاربرد در دژنراسیون ماکولا وابسته به سن و بیماریهای ناشی از جهشهای غالب5).
تزریق در فضای فوقمشیمیهای: به عنوان یک مسیر جدید برای درمان گسترده RPE محیطی و مشیمیه در حال تحقیق است5).
در بسیاری از گزارشها، حتی در چشمهایی که CRA رخ داده است، بینایی (BCVA) حفظ میشود و بهبود FST نیز تمایل به تداوم دارد4). با این حال، اگر CRA به ناحیه فووه مرکزی گسترش یابد، نگرانیهایی در مورد تأثیر بر بینایی وجود دارد. الگوی رشد CRA در بین افراد بسیار متفاوت است و نیاز به پایش طولانیمدت تصویربرداری دارد.
