آزمایش سلولهای اندوتلیال قرنیه (میکروسکوپ اسپکولار) آزمایشی است که با استفاده از اصل بازتاب آینهای، سلولهای اندوتلیال قرنیه را تصویربرداری و تحلیل میکند. این آزمایش میتواند تراکم سلولی، مورفولوژی و ناهمسانی اندازه را به صورت غیرتهاجمی و کمی ارزیابی کند.
سلولهای اندوتلیال قرنیه یک لایه سلولی منفرد در سطح پشتی قرنیه هستند که با عملکرد پمپ و سد، شفافیت قرنیه را حفظ میکنند. با این حال، ارزیابی کمی مستقیم این عملکردها دشوار است. بنابراین، برای ارزیابی عملکرد اندوتلیال، معمولاً تغییرات مورفولوژیکی پارامترسازی میشوند. اگرچه ارزیابی کیفی سلولهای اندوتلیال با بازتاب آینهای در میکروسکوپ شکافدار امکانپذیر است، استفاده از میکروسکوپ اسپکولار امکان کمیسازی پارامترهای مورفولوژیکی را فراهم میکند.
موارد کاربرد اصلی:
سلولهای اندوتلیال قرنیه با عملکرد پمپ و سد، قرنیه را شفاف نگه میدارند. استرومای قرنیه دارای فشار تورژسانس حدود 50 میلیمتر جیوه است، اما در چشم طبیعی، عملکرد پمپ اندوتلیال بر آن غلبه کرده و آب اضافی را از قرنیه خارج میکند. از آنجایی که سلولهای اندوتلیال تقریباً توانایی بازسازی ندارند، در صورت آسیب، سلولهای باقیمانده بزرگ و مسطح میشوند تا جایگزین شوند، اما اگر تراکم به طور قابل توجهی کاهش یابد، جبران نارسایی رخ داده و ادم قرنیه ایجاد میشود.
میکروسکوپهای اسپکولار بر اساس اصل اندازهگیری و روش تماس به سه نوع اصلی تقسیم میشوند.
نوع غیرتماسی
ویژگی: مدلهای رایج در عمل بالینی فعلی. نیاز به بیحسی موضعی ندارند و از تراز خودکار پشتیبانی میکنند.
مزایا: ناراحتی کمتر برای بیمار و عدم خطر عفونت. میتوان در مدت کوتاه و به طور مکرر اندازهگیری کرد.
محدودیت: محدوده تصویربرداری نسبتاً محدود است. در موارد ادم یا کدورت شدید قرنیه، تصویربرداری دقیق دشوار میشود.
نوع تماسی
ویژگی: روشی که در آن لنز مستقیماً با قرنیه تماس پیدا میکند. نیاز به بیحسی قطرهای (اوکسیبوپروکائین ۰٫۴٪) دارد.
مزایا: امکان تصویربرداری وسیعتر و واضحتر نسبت به نوع غیرتماسی. در موارد ادم یا کدورت قرنیه نتایج قابل اعتمادتری به دست میدهد. گزارش شده است که در قرنیههای سالم و پس از پیوند، مقادیر تراکم سلولی در نوع تماسی و غیرتماسی تقریباً معادل است [4].
محدودیت: نیاز به بیحسی قطرهای. نیاز به مهارت بالای اپراتور.
میکروسکوپ کانفوکال
ویژگی: دستگاه ویژهای که امکان مشاهده لایههای مختلف قرنیه به صورت مقطعی را فراهم میکند.
مزایا: امکان ارزیابی سهبعدی سلولهای لایههای اپیتلیوم، استروما و اندوتلیوم، نه فقط اندوتلیوم. همچنین برای مشاهده شبکه عصبی کاربرد دارد.
محدودیت: عملکرد پیچیدهتر و زمان معاینه طولانیتر نسبت به اسپکولار معمولی. نیاز به دستگاه اختصاصی.
اگر تعداد سلولهای مورد استفاده برای تحلیل خیلی کم باشد، قابلیت اطمینان آزمایش کاهش مییابد. Doughty و همکاران گزارش کردهاند که در اندازهگیری با میکروسکوپ اسپکولار غیرتماسی، با ۲۵ سلول تحلیلشده، ضریب تغییرات حدود ±۱۰٪ است، در حالی که با ۷۵ سلول یا بیشتر، به حدود ±۲٪ کاهش مییابد [2]. تحلیل Abib و همکاران نیز نشان میدهد که اگرچه اندازه نمونه مورد نیاز بسته به دستگاه متفاوت است، اما در همه موارد چند صد سلول مطلوب است [3]. حتماً تعداد سلولهای شناساییشده توسط نرمافزار تحلیل را بررسی کنید.
در موارد ادم قرنیه یا کدورت، تصویربرداری دقیق دشوار است و قابلیت اطمینان نتایج تحلیل کاهش مییابد. در این موارد، سعی کنید از ناحیهای با شفافیت بیشتر تصویربرداری کنید. استفاده از نوع تماسی به دلیل امکان تصویربرداری وسیعتر و واضحتر مفید است.
در نوع غیرتماسی نیازی به بیحسی قطرهای نیست و اگرچه ممکن است احساس خیرگی ایجاد شود، اما اساساً دردی ندارد. در نوع تماسی، پس از بیحسی با قطره چشمی اکسیبوپروکائین ۰٫۴٪، لنز را تماس میدهند، بنابراین تا زمانی که بیحسی مؤثر است، درد احساس نمیشود. هر دو آزمایش در مدت کوتاهی انجام میشوند.
وضعیت سلولهای اندوتلیال با سه پارامتر اصلی زیر ارزیابی میشود.
| پارامتر | مقدار طبیعی | راهنمای مقدار غیرطبیعی |
|---|---|---|
| تراکم سلولی (CD) | بالای ۷۰ سال: میانگین ۲۲۰۰ سلول در میلیمتر مربع | ۴۰۰ تا ۵۰۰ سلول در میلیمتر مربع یا کمتر |
| مقدار CV (ضریب تغییرات) | 0.2 تا 0.3 | 0.35 یا بیشتر |
| درصد سلولهای ششضلعی (Hexagonality) | 60 تا 70% | 50% یا کمتر |
تراکم سلولی شاخص اصلی ارزیابی اندوتلیوم است. مطالعات متعدد نشان دادهاند که با افزایش سن به طور فیزیولوژیک کاهش مییابد [1][6] و تقریباً روند زیر را طی میکند.
هنگامی که تراکم سلولی به کمتر از 400 تا 500 سلول در میلیمتر مربع کاهش یابد، حفظ شفافیت قرنیه غیرممکن شده و کراتوپاتی تاولی ایجاد میشود.
مقدار CV (ضریب تغییرات) حاصل تقسیم انحراف معیار مساحت سلول بر میانگین مساحت سلول است و نشاندهنده ناهمسانی اندازه سلولها میباشد. افزایش آن به معنای اعمال استرس بیشتر به سلول است. مقدار طبیعی بین 0.2 تا 0.3 است و 0.35 یا بالاتر به عنوان غیرطبیعی در نظر گرفته میشود.
سلولهای اندوتلیال قرنیه طبیعی به طور منظم به صورت ششضلعی مرتب شدهاند. کاهش درصد این سلولهای ششضلعی نشاندهنده بینظمی بیشتر در شکل سلولها است. مقدار طبیعی 60 تا 70 درصد است و 50 درصد یا کمتر به عنوان غیرطبیعی در نظر گرفته میشود.
در دیستروفی اندوتلیال قرنیه فوکس، یافتههای مشخصه زیر با میکروسکوپ اسپکولار مشاهده میشود:
هیچ معیار یکسانی وجود ندارد و بین مراکز متفاوت است، اما به طور کلی اگر تراکم سلولی (CD) کمتر از 1000 سلول در میلیمتر مربع باشد، خطر جراحی بالا در نظر گرفته میشود. انتخاب روش جراحی (کاهش زمان اولتراسوند در جراحی آب مروارید با اولتراسوند یا استفاده بیشتر از مواد ویسکوالاستیک) و کسب رضایت آگاهانه کافی از بیمار ضروری است. اگر CD به 400-500 سلول در میلیمتر مربع یا کمتر کاهش یابد، خطر ایجاد کراتوپاتی تاولی پس از جراحی وجود دارد و ممکن است جراحی همزمان آب مروارید و پیوند اندوتلیال قرنیه (DSAEK/DMEK) در نظر گرفته شود.
بسته به غیرطبیعی بودن مقادیر آزمایش، اقدامات زیر در نظر گرفته میشود.
CD < 1000 سلول در میلیمتر مربع (قبل از جراحی آب مروارید): این وضعیت خطر بالای جراحی را نشان میدهد. باید روش جراحی را با کاهش زمان اولتراسوند و انتخاب مواد ویسکوالاستیک مناسب اصلاح کرد و خطرات را به طور کامل برای بیمار توضیح داد. از آنجایی که معیارهای تصمیمگیری در مراکز مختلف متفاوت است، قضاوت جامع پزشک معالج اهمیت دارد.
CD < 400 تا 500 سلول در میلیمتر مربع: خطر کراتوپاتی تاولی قریبالوقوع است. باید به طور فعال پیوند اندوتلیال قرنیه (DSAEK/DMEK) را در نظر گرفت. در مقایسه با پیوند نافذ قرنیه (PKP)، DSAEK/DMEK میزان بقای بالاتر سلولهای اندوتلیال و بهبود سریعتر بینایی را دارد.
CV > 0.35 یا هگزاگونالیته < 50%: نشاندهنده استرس اندوتلیال است. باید عللی مانند دیستروفی اندوتلیال فوکس، سندرم ICE، استفاده طولانی مدت از لنزهای تماسی و سابقه جراحی داخل چشمی را بررسی کرد.
پیگیری پس از جراحی:
میکروسکوپ اسپکولار از بازتاب آینهای نور برای تجسم سلولهای اندوتلیال استفاده میکند. هنگامی که نور به سطح مشترک بین استرومای قرنیه و زلالیه (لایه سلولهای اندوتلیال) تابانده میشود، بخشی از نور در مرز دو محیط با ضریب شکست متفاوت به صورت آینهای بازتاب مییابد. با دریافت این نور بازتابی، تصویر سلولهای اندوتلیال به دست میآید.
در مرز سلولها (فضای بین سلولی)، بازتاب ضعیف است و تیره به نظر میرسد (خط تیره)، در حالی که بدنه سلول روشن دیده میشود. این امر باعث نمایان شدن مرز سلولها میشود. نرمافزار تحلیل تصویر، تصویر سلولی گرفته شده را به طور خودکار تشخیص و کمّیسازی میکند و CD، CV و هگزاگونالیته محاسبه میشوند.
استرومای قرنیه همواره دارای فشار تورمی (swelling pressure: SP) حدود 50 میلیمتر جیوه است. در چشم طبیعی، پمپ اندوتلیال قرنیه به طور فعال Na⁺ و HCO₃⁻ را به سمت زلالیه انتقال میدهد و با غلبه بر این فشار تورمی، قرنیه را در ضخامت فیزیولوژیک خود نگه داشته و شفافیت آن را حفظ میکند.
هنگامی که تراکم سلولهای اندوتلیال به کمتر از 500 سلول در میلیمتر مربع کاهش یابد، عملکرد پمپ سلولهای اندوتلیال باقیمانده دچار جبرانناکافی میشود. آب بیش از فشار تورمی استرومای قرنیه وارد شده و از ادم استروما به تشکیل تاول زیر اپیتلیال (bulla) منجر میشود. این وضعیت کراتوپاتی تاولی (bullous keratopathy) نامیده میشود. پارگی تاول باعث درد شدید و از دست رفتن عملکرد سد سطحی چشم میشود.
نرمافزارهای تحلیل خودکار سنتی، بهویژه در نواحی با تراکم سلولی پایین یا موارد ادم، با چالشهایی در دقت تشخیص مواجه بودند. در سالهای اخیر، تحقیقات در زمینه تشخیص خودکار مرزهای سلولی با استفاده از یادگیری ماشین و یادگیری عمیق پیشرفت کرده است. همبستگی خوبی با تحلیل دستی گزارش شده است و انتظار میرود در آینده به صورت بالینی پیادهسازی شود.
تحقیقات پایه نشان داده است که مهارکنندههای کیناز مرتبط با Rho (ROCK) باعث افزایش چسبندگی و تکثیر سلولهای اندوتلیال قرنیه میشوند. در ژاپن، توسعه بالینی قطره چشمی مهارکننده ROCK (مشتق Y-27632) با هدف افزایش تکثیر سلولهای اندوتلیال قرنیه در حال انجام است. کاربرد آن در کراتوپاتی تاولی و بهبود تراکم اندوتلیوم پس از پیوند اندوتلیال قرنیه در مرحله تحقیق مورد توجه است، اما در حال حاضر به طور گسترده در عمل بالینی استفاده نمیشود.
استفاده طولانی مدت از لنزهای تماسی (به ویژه لنزهای سخت) به دلیل هیپوکسی مزمن قرنیه، باعث افزایش پلیمگاتیسم (ناهمسانی اندازه سلولها) و پلئومورفیسم (افزایش سلولهای غیر شش ضلعی) در اندوتلیوم میشود. این تغییرات به صورت افزایش CV و کاهش Hexagonality ظاهر میشوند، اما تراکم سلولی اغلب در محدوده طبیعی باقی میماند.
استفاده طولانی مدت از آمانتادین (داروی پارکینسون) و برخی داروهای ضد روانپریشی با آسیب اندوتلیال قرنیه همراه بوده است. این آسیب ممکن است با اسپکولار میکروسکوپ به صورت کاهش تراکم سلولی و تغییرات مورفولوژیکی قابل تشخیص باشد. سودمندی پایش منظم در بیماران تحت درمان با این داروها در حال بررسی است.
