Исследование эндотелиальных клеток роговицы (зеркальная микроскопия) — это исследование, которое фотографирует и анализирует эндотелиальные клетки роговицы, используя принцип зеркального отражения. Оно позволяет неинвазивно количественно оценить плотность клеток, морфологию и анизоцитоз.
Эндотелиальные клетки роговицы образуют однослойный слой на задней поверхности роговицы и поддерживают прозрачность роговицы благодаря насосной и барьерной функциям. Однако количественно оценить эти функции напрямую сложно. Поэтому оценка функции эндотелия обычно проводится путем параметризации изменений морфологических аномалий. Хотя качественная оценка эндотелиальных клеток возможна с помощью зеркального отражения при щелевой лампе, использование зеркального микроскопа позволяет количественно определить морфологические параметры.
Основные показания:
Эндотелиальные клетки роговицы поддерживают прозрачность роговицы благодаря насосной и барьерной функциям. В строме роговицы существует давление набухания около 50 мм рт. ст., но в нормальном глазу насосная функция эндотелия преодолевает это давление и удаляет избыток воды из роговицы. Эндотелиальные клетки практически не обладают регенеративной способностью, поэтому при повреждении оставшиеся клетки расширяются и уплощаются, чтобы компенсировать потерю, но при значительном снижении плотности наступает декомпенсация, приводящая к отеку роговицы.
Существует в основном три типа зеркальных микроскопов, различающихся по принципу измерения и способу контакта.
Бесконтактный тип
Характеристики: В настоящее время преобладающие в клинике модели. Не требуют местной анестезии, поддерживают автоюстировку.
Преимущества: Малая нагрузка на пациента, отсутствие риска инфицирования. Быстрые и повторяемые измерения.
Ограничения: Область съемки несколько ограничена. При выраженном отеке или помутнении роговицы точная съемка затруднена.
Контактный тип
Особенности: Метод, при котором линза непосредственно контактирует с роговицей. Требуется местная анестезия (0,4% оксибупрокаин).
Преимущества: Позволяет получать более широкие и четкие изображения, чем бесконтактный тип. Даже при отеке или помутнении роговицы получаются надежные результаты. Сообщается, что измерения плотности клеток на здоровых и трансплантированных роговицах в целом эквивалентны между контактным и бесконтактным типами [4].
Ограничения: Требуется местная анестезия. Требуется опытная техника.
Конфокальный микроскоп
Особенности: Специальное устройство, позволяющее наблюдать слои роговицы в разрезе.
Преимущества: Позволяет трехмерно оценивать не только эндотелий, но и эпителий, строму и клетки каждого слоя. Также подходит для наблюдения нервного сплетения.
Ограничения: Управление сложнее, а время исследования больше, чем у обычного зеркального микроскопа. Требуется специальное оборудование.
Слишком малое количество клеток, используемых для анализа, снижает достоверность исследования. Doughty и соавт. сообщают, что при измерении бесконтактным зеркальным микроскопом коэффициент вариации составляет около ±10% для 25 анализируемых клеток, но стабилизируется на уровне около ±2% для 75 и более клеток [2]. Анализ Abib и соавт. показывает, что необходимый размер выборки варьируется в зависимости от модели, но во всех случаях желателен порядок нескольких сотен клеток [3]. Всегда проверяйте количество клеток, автоматически распознанных программным обеспечением для анализа.
При отеке или помутнении роговицы точная визуализация затруднена, и достоверность результатов анализа снижается. В таких случаях попробуйте выполнить съемку повторно на более прозрачном участке. Использование контактного типа позволяет получить более широкое и четкое изображение, что полезно.
При бесконтактном типе не требуется местная анестезия; может ощущаться ослепление, но в основном боли нет. При контактном типе перед контактом линзы проводится местная анестезия 0,4% раствором оксибупрокаина, поэтому во время действия анестезии боль практически не ощущается. Оба исследования занимают короткое время.
Состояние эндотелиальных клеток оценивается по следующим трем основным параметрам.
| Параметр | Нормальное значение | Порог патологии |
|---|---|---|
| Плотность клеток (CD) | ≥70 лет: в среднем 2 200 клеток/мм² | ≤ 400–500 клеток/мм² |
| Значение CV (коэффициент вариации) | 0,2–0,3 | 0,35 и выше |
| Частота появления шестиугольных клеток (Hexagonality) | 60–70 % | 50 % и менее |
Плотность клеток является центральным показателем оценки эндотелия. Многочисленные исследования показали, что с возрастом она физиологически снижается [1][6], примерно по следующей динамике.
Когда плотность клеток падает ниже 400–500 клеток/мм², поддержание прозрачности роговицы становится невозможным, что приводит к буллезной кератопатии.
Значение CV представляет собой коэффициент вариации (стандартное отклонение площади клеток, деленное на среднюю площадь клеток) и указывает на анизоцитоз (различие в размерах клеток). Увеличение означает, что клетки испытывают стресс. Нормальное значение составляет 0,2–0,3, а значение 0,35 и выше считается аномальным.
Нормальные эндотелиальные клетки роговицы расположены в правильном гексагональном порядке. Снижение доли этих гексагональных клеток указывает на большее нарушение морфологии клеток. Нормальное значение составляет 60–70%, а значение 50% и ниже считается аномальным.
При дистрофии эндотелия роговицы Фукса при спекулярной микроскопии наблюдаются следующие характерные признаки:
Четкого единого стандарта нет, и существуют различия между учреждениями, но в целом плотность клеток ниже 1000 клеток/мм² считается высоким риском операции. Необходимы выбор хирургической техники (сокращение времени ультразвука при факоэмульсификации или дополнительное использование вязкоэластичных веществ) и достаточное информированное согласие пациента. Если плотность клеток падает до 400–500 клеток/мм² или ниже, существует риск развития буллезной кератопатии после операции, и может рассматриваться одновременное проведение операции по удалению катаракты и трансплантации эндотелия роговицы (DSAEK/DMEK).
В зависимости от аномалий значений обследования рассматриваются следующие меры.
CD < 1000 клеток/мм² (перед операцией по удалению катаракты) : Высокий хирургический риск. Адаптировать методику операции (сокращение времени ультразвука, выбор вязкоэластичного материала) и подробно объяснить пациенту риски. Критерии принятия решений различаются в зависимости от учреждения, поэтому важно общее суждение лечащего врача.
CD < 400–500 клеток/мм² : Риск буллезной кератопатии является непосредственным. Активно рассматривать показания к трансплантации эндотелия роговицы (DSAEK/DMEK). По сравнению с пересадкой роговицы на всю толщину (PKP), DSAEK/DMEK имеет более высокую выживаемость эндотелиальных клеток и более быстрое восстановление зрения.
CV > 0,35 или Hexagonality < 50% : Указывает на состояние стресса эндотелия. Искать причины, такие как эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса, синдром ICE, длительное ношение контактных линз, внутриглазные операции в анамнезе.
Послеоперационное наблюдение :
Спекулярный микроскоп использует зеркальное отражение света для визуализации эндотелиальных клеток. При освещении границы между стромой роговицы и водянистой влагой (слой эндотелиальных клеток) часть света зеркально отражается на границе сред с разными показателями преломления. Прием этого отраженного света позволяет получить изображение эндотелиальных клеток.
На границах клеток (межклеточных пространствах) отражение слабое, и они выглядят темными (темные линии), тогда как тело клетки выглядит светлым. Это позволяет выделить контуры клеток. Захваченные изображения клеток автоматически распознаются и количественно оцениваются программным обеспечением для анализа изображений, что позволяет рассчитать CD, CV и Hexagonality.
В строме роговицы постоянно существует давление набухания (swelling pressure: SP) около 50 мм рт. ст. В нормальном глазу насос эндотелия роговицы активно транспортирует Na⁺ и HCO₃⁻ в сторону водянистой влаги, преодолевая это давление набухания, поддерживая роговицу физиологической толщины и сохраняя прозрачность.
Когда плотность эндотелиальных клеток падает ниже 500 клеток/мм², насосная функция оставшихся эндотелиальных клеток становится недостаточной. Вода, превышающая давление набухания стромы роговицы, проникает внутрь, что приводит к отеку стромы и образованию субэпителиальных пузырей (bulla). Это буллезная кератопатия (bullous keratopathy). Разрыв пузырей вызывает сильную боль, а также теряется барьерная функция поверхности глаза.
Традиционное программное обеспечение для автоматического анализа имело проблемы с точностью распознавания, особенно в областях с низкой плотностью клеток или в случаях отека. В последние годы прогрессируют исследования автоматического распознавания границ клеток с использованием машинного обучения и глубокого обучения. Сообщается о хорошей корреляции точности с ручным анализом, и ожидается будущее клиническое внедрение.
Фундаментальные исследования показали, что ингибиторы Rho-ассоциированной киназы (ROCK) способствуют адгезии и пролиферации клеток эндотелия роговицы. В Японии ведется клиническая разработка глазных капель с ингибитором ROCK (производные Y-27632), направленных на стимуляцию пролиферации клеток эндотелия роговицы. Их применение при буллезной кератопатии и восстановлении плотности эндотелия после эндотелиальной трансплантации изучается на исследовательском этапе, но в настоящее время они не получили широкого применения в общей клинической практике.
Длительное ношение контактных линз (особенно жестких) может привести к увеличению полиморфизма (полимегетизм: увеличение вариабельности размеров клеток) и плеоморфизма (увеличение количества клеток нешестиугольной формы) в эндотелии из-за хронической гипоксии роговицы. Это проявляется повышением значения CV и снижением гексагональности, но сама плотность клеток часто остается в пределах нормы.
Сообщалось о поражении эндотелия роговицы при длительном применении амантадина (противопаркинсоническое средство) и некоторых антипсихотиков. Они могут быть обнаружены с помощью зеркальной микроскопии как снижение плотности клеток и морфологические изменения, и изучается полезность регулярного мониторинга у пациентов, принимающих эти препараты.
