L’esame delle cellule endoteliali corneali (microscopio speculare) è un esame che fotografa e analizza le cellule endoteliali corneali utilizzando il principio della riflessione speculare. Consente una valutazione quantitativa non invasiva della densità cellulare, della morfologia e dell’anisocitosi.
Le cellule endoteliali corneali formano un monostrato sulla superficie posteriore della cornea e mantengono la trasparenza corneale grazie alle funzioni di pompa e barriera. Tuttavia, è difficile valutare direttamente queste funzioni in modo quantitativo. Pertanto, la valutazione della funzione endoteliale viene generalmente effettuata parametrizzando i cambiamenti nelle anomalie morfologiche. Sebbene una valutazione qualitativa delle cellule endoteliali sia possibile mediante riflessione speculare al microscopio a fessura, l’uso di un microscopio speculare consente la quantificazione dei parametri morfologici.
Indicazioni principali:
Le cellule endoteliali corneali mantengono la trasparenza della cornea grazie alle funzioni di pompa e barriera. Lo stroma corneale ha una pressione di rigonfiamento di circa 50 mmHg, ma in un occhio normale la funzione di pompa dell’endotelio supera questa pressione e rimuove l’acqua in eccesso dalla cornea. Le cellule endoteliali hanno una capacità rigenerativa quasi nulla, quindi quando vengono danneggiate, le cellule residue si allargano e si appiattiscono per compensare, ma se la densità diminuisce notevolmente, si verifica uno scompenso che porta all’edema corneale.
Esistono principalmente tre tipi di microscopi speculari, che differiscono per principio di misurazione e modalità di contatto.
Tipo senza contatto
Caratteristiche: Modelli attualmente predominanti in clinica. Non richiedono anestesia topica e supportano l’allineamento automatico.
Vantaggi: Basso carico per il paziente, nessun rischio di infezione. Misurazioni rapide e ripetibili.
Limiti: L’area di acquisizione è alquanto limitata. In caso di edema o opacità corneale grave, l’acquisizione accurata diventa difficile.
Tipo a contatto
Caratteristiche: Metodo in cui la lente viene messa a diretto contatto con la cornea. È necessaria l’anestesia topica (ossibuprocaina 0,4%).
Vantaggi: Consente un’acquisizione più ampia e nitida rispetto al tipo senza contatto. Risultati affidabili si ottengono anche in caso di edema o opacità corneale. È stato riportato che le misurazioni della densità cellulare sono generalmente equivalenti tra i tipi a contatto e senza contatto per cornee sane e post-trapianto [4].
Limiti: Richiede anestesia topica. Richiede una tecnica esperta.
Microscopio confocale
Caratteristiche: Dispositivo speciale in grado di osservare gli strati della cornea in sezione.
Vantaggi: Consente una valutazione tridimensionale non solo dell’endotelio, ma anche dell’epitelio, dello stroma e delle cellule di ogni strato. Adatto anche per l’osservazione del plesso nervoso.
Limiti: La manipolazione è più complessa e il tempo di esame più lungo rispetto a un microscopio speculare standard. È necessaria un’apparecchiatura dedicata.
Un numero troppo basso di cellule analizzate riduce l’affidabilità dell’esame. Doughty et al. riportano che con il microscopio speculare a non contatto, il coefficiente di variazione è di circa ±10% per 25 cellule analizzate, mentre si stabilizza a circa ±2% per 75 o più cellule [2]. L’analisi di Abib et al. mostra che la dimensione del campione necessaria varia a seconda del modello, ma in tutti i casi è desiderabile un ordine di diverse centinaia di cellule [3]. Controllare sempre il numero di cellule riconosciute automaticamente dal software di analisi.
In caso di edema o opacità corneale, l’imaging accurato è difficile e l’affidabilità dei risultati dell’analisi è ridotta. In tal caso, provare a ripetere l’imaging in un’area più trasparente. L’uso del tipo a contatto consente un imaging più ampio e nitido, quindi è utile.
Con il tipo non a contatto non è necessaria l’anestesia topica; si può avvertire abbagliamento ma fondamentalmente nessun dolore. Con il tipo a contatto, viene applicata un’anestesia topica con collirio di ossibuprocaina allo 0,4% prima del contatto con la lente, quindi durante l’effetto anestetico il dolore è difficilmente percepibile. Entrambi gli esami sono di breve durata.
Lo stato delle cellule endoteliali viene valutato mediante i seguenti tre parametri principali.
| Parametro | Valore normale | Soglia di anormalità |
|---|---|---|
| Densità cellulare (CD) | ≥70 anni: media 2.200 cellule/mm² | ≤ 400–500 cellule/mm² |
| Valore CV (coefficiente di variazione) | 0,2–0,3 | 0,35 o superiore |
| Percentuale di cellule esagonali (Hexagonality) | 60–70 % | 50 % o inferiore |
La densità cellulare è un indicatore centrale della valutazione endoteliale. Diversi studi hanno dimostrato che diminuisce fisiologicamente con l’età [1][6], seguendo approssimativamente il seguente andamento.
Quando la densità cellulare scende al di sotto di 400–500 cellule/mm², il mantenimento della trasparenza corneale diventa impossibile, portando a una cheratopatia bollosa.
Il valore CV è il coefficiente di variazione (deviazione standard dell’area cellulare divisa per l’area cellulare media) e indica l’anisocitosi (variazione delle dimensioni cellulari). Un aumento significa che le cellule sono sotto stress. Il valore normale è 0,2–0,3 e un valore pari o superiore a 0,35 è considerato anomalo.
Le cellule endoteliali corneali normali sono disposte in un pattern esagonale regolare. Una diminuzione della percentuale di queste cellule esagonali indica un maggiore disordine della morfologia cellulare. Il valore normale è 60–70% e un valore pari o inferiore al 50% è considerato anomalo.
Nella distrofia endoteliale di Fuchs, al microscopio speculare si osservano i seguenti reperti caratteristici:
Non esiste uno standard unico chiaro e ci sono differenze tra le strutture, ma in generale una densità cellulare inferiore a 1.000 cellule/mm² è considerata ad alto rischio chirurgico. Sono necessari la selezione della tecnica chirurgica (riduzione del tempo di ultrasuoni per la facoemulsificazione o uso aggiuntivo di sostanze viscoelastiche) e un adeguato consenso informato del paziente. Se la densità cellulare scende a 400–500 cellule/mm² o meno, esiste il rischio di cheratopatia bollosa dopo l’intervento e può essere presa in considerazione la chirurgia combinata di cataratta e trapianto endoteliale corneale (DSAEK/DMEK).
In base alle anomalie dei valori degli esami, vengono considerate le seguenti misure.
CD < 1.000 cellule/mm² (prima dell’intervento di cataratta) : Stato ad alto rischio chirurgico. Adattare la tecnica operatoria (riduzione del tempo di ultrasuoni, scelta del materiale viscoelastico) e spiegare adeguatamente i rischi al paziente. I criteri decisionali variano a seconda dell’istituto, quindi è importante il giudizio complessivo del medico curante.
CD < 400-500 cellule/mm² : Rischio imminente di cheratopatia bollosa. Valutare attivamente l’indicazione al trapianto endoteliale corneale (DSAEK/DMEK). Rispetto al trapianto di cornea a tutto spessore (PKP), DSAEK/DMEK ha un tasso di sopravvivenza delle cellule endoteliali più elevato e un recupero visivo più rapido.
CV > 0,35 o Hexagonality < 50% : Indica uno stato di stress endoteliale. Ricercare cause come distrofia endoteliale di Fuchs, sindrome ICE, uso prolungato di lenti a contatto, storia di chirurgia intraoculare.
Follow-up postoperatorio :
Il microscopio speculare utilizza la riflessione speculare della luce per visualizzare le cellule endoteliali. Illuminando l’interfaccia tra lo stroma corneale e l’umor acqueo (strato di cellule endoteliali), una parte della luce viene riflessa specularmente al confine tra mezzi con diversi indici di rifrazione. Ricevendo questa luce riflessa si ottiene un’immagine delle cellule endoteliali.
Ai confini cellulari (spazi intercellulari) la riflessione è debole e appaiono scuri (linea scura), mentre il corpo cellulare appare luminoso. Ciò fa risaltare i contorni delle cellule. Le immagini cellulari catturate vengono automaticamente riconosciute e quantificate dal software di analisi delle immagini, consentendo di calcolare CD, CV e Hexagonality.
Nello stroma corneale è sempre presente una pressione di rigonfiamento (swelling pressure: SP) di circa 50 mmHg. Nell’occhio normale, la pompa endoteliale corneale trasporta attivamente Na⁺ e HCO₃⁻ verso l’umor acqueo, superando questa pressione di rigonfiamento per mantenere la cornea a uno spessore fisiologico e preservare la trasparenza.
Quando la densità delle cellule endoteliali scende al di sotto di 500 cellule/mm², la funzione di pompa delle cellule endoteliali residue diventa insufficiente. L’acqua in eccesso rispetto alla pressione di rigonfiamento dello stroma corneale entra, causando edema stromale e formazione di bolle subepiteliali (bulla). Questa è la cheratopatia bollosa (bullous keratopathy). La rottura delle bolle provoca dolore intenso e si perde anche la funzione di barriera della superficie oculare.
I software di analisi automatica tradizionali presentavano difficoltà nella precisione di riconoscimento, specialmente in aree a bassa densità cellulare o in casi di edema. Recentemente, la ricerca sul riconoscimento automatico dei confini cellulari utilizzando l’apprendimento automatico e il deep learning è progredita. È stata riportata una buona correlazione di precisione con l’analisi manuale e si prevede una futura implementazione clinica.
Studi di base hanno dimostrato che gli inibitori della Rho-associated kinase (ROCK) promuovono l’adesione e la proliferazione delle cellule endoteliali corneali. In Giappone, è in corso lo sviluppo clinico di colliri inibitori di ROCK (derivati di Y-27632) volti a promuovere la proliferazione delle cellule endoteliali corneali. La loro applicazione per la cheratopatia bollosa e il recupero della densità endoteliale dopo trapianto endoteliale è in fase di studio, ma al momento non sono ampiamente utilizzati nella pratica clinica generale.
L’uso prolungato di lenti a contatto (in particolare lenti rigide) può causare un aumento del polimegetismo (aumento della variabilità delle dimensioni cellulari) e del pleomorfismo (aumento delle forme cellulari non esagonali) nell’endotelio a causa dell’ipossia corneale cronica. Ciò si manifesta con un aumento del valore CV e una diminuzione dell’esagonalità, ma la densità cellulare stessa spesso rimane entro l’intervallo normale.
Sono stati riportati danni endoteliali corneali con l’uso a lungo termine di amantadina (farmaco antiparkinsoniano) e di alcuni antipsicotici. Possono essere rilevati tramite microscopia speculare come diminuzione della densità cellulare e alterazioni morfologiche, e l’utilità di un monitoraggio regolare nei pazienti che assumono questi farmaci è in fase di studio.
