الأديم الظاهر السطحي
ظهارة القرنية: تتمايز بعد انفصال الحويصلة العدسية
العدسة: تتكون من انغماد الأديم الظاهر السطحي
ظهارة الجفن والملتحمة: مشتقة من الأديم الظاهر السطحي
الغدة الدمعية وغدة ميبوم: تتطوران من ظهارة الملتحمة
علم الأجنة للعين وملحقات العين (Embryology of the Eye and Ocular Adnexa)
1. ما هو علم الأجنة للعين وملحقاتها
Section titled “1. ما هو علم الأجنة للعين وملحقاتها”العين هي عضو يتكون من بروز جزء من الدماغ أثناء التطور. تنشأ نتوءان من الجزء الأمامي من الحويصلة الدماغية البدائية، لتشكلا الحويصلة البصرية البدائية. تتكون الشبكية العصبية والدماغ من نفس الأديم الظاهر العصبي، ويمكن القول إنها “جزء من الدماغ”.
التطور الجنيني المبكر
Section titled “التطور الجنيني المبكر”يبدأ تطور العين بـ المَعِدَة (gastrulation). تتحول الأريمة إلى مضغة، وتتكون الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم الباطن، والأديم المتوسط، والأديم الظاهر. بحلول الأسبوع الثالث من التطور، تشكل الطبقات الثلاث قرصًا جنينيًا ثلاثي الطبقات.
بعد المَعِدَة مباشرة، يحدث تكون الأنبوب العصبي (neurulation). تنثني الصفيحة العصبية إلى الداخل لتشكل الأنبوب العصبي، ويظهر التلم البصري (optic groove) على الطيات العصبية حوالي اليوم 22 من الحمل. بحلول اليوم 25، يتطور التلم البصري إلى الحويصلة البصرية (optic vesicle).
تكون الكأس البصري
Section titled “تكون الكأس البصري”عندما يقترب الطرف البعيد للحويصلة البصرية من الأديم الظاهر السطحي، يثخن الأديم الظاهر السطحي ليشكل صفيحة العدسة (lens plate). ينغمس الجدار الأمامي للحويصلة البصرية ليقترب من الجدار الخلفي، مكونًا بنية كأسية مزدوجة الجدار تُسمى الكأس البصري (optic cup).
الجزء الأنبوبي الذي يربط الكأس البصري ببطين الدماغ يُسمى الساق البصري (optic stalk). يتطور الساق البصري في النهاية إلى العصب البصري.
الأنسجة الأربعة المساهمة في تطور العين
Section titled “الأنسجة الأربعة المساهمة في تطور العين”تتكون العين وملحقاتها من أربعة أنسجة:
الأديم الظاهر العصبي
الشبكية والظهارة الصبغية للشبكية: تتمايزان من الصفيحتين الداخلية والخارجية للكأس البصري
ظهارة القزحية والجسم الهدبي: مشتقتان من الحافة الأمامية للكأس البصري
العصب البصري: يتكون من محاور الخلايا العقدية الشبكية
الجسم الزجاجي: أكبر مساهمة من حيث الحجم النسبي
الأديم المتوسط
العضلات خارج العين: تتكون من القسيمات العضلية أمام الأذن
الدهون والنسيج الضام في الحجاج: مشتقة من الأديم المتوسط
الشبكة الوعائية المشيمية: تُستحث من الأديم المتوسط المحيط بالكأس البصري
النسيج المحيط بالعضلة الهدبية: مساهمة من الأديم المتوسط
خلايا العرف العصبي (الأديم الباطن الرابع)
سدى القرنية وبطانتها: تتكون من هجرة خلايا العرف العصبي
سدى القزحية: يحدد تركيز الميلانين لون القزحية
الصلبة والشبكة التربيقية: مشتقة من العرف العصبي
عظام الحجاج: تتعظم بشكل رئيسي من سلالة العرف العصبي
العرف العصبي هو بنية تتشكل مؤقتًا بين الأديم الظاهر السطحي والصفيحة العصبية أثناء تكوين الأنبوب العصبي في الفقاريات، ويُطلق عليه “الأديم الباطن الرابع” لأهميته. تهاجر خلايا العرف العصبي عبر إزالة الظهارة والتحول الظهاري-اللحمي المتوسط إلى أجزاء مختلفة من الجنين، وتلعب دورًا مهمًا في تطور العين.
Q
متى يبدأ تطور العين؟
A
يبدأ تطور العين في الأسبوع الثالث من الحمل (حوالي اليوم 22 من الحمل) بظهور التلم العيني على الصفيحة العصبية. بحلول اليوم 25، يتطور إلى الحويصلة البصرية، ثم يتقدم عبر تكوين الكأس البصرية إلى تمايز الأنسجة المختلفة. يتشكل الهيكل الأساسي للعين خلال الفترة الجنينية، ويستمر اكتمال النقرة حتى 16 أسبوعًا بعد الولادة.
3. الأسباب وعوامل الخطر
Section titled “3. الأسباب وعوامل الخطر”يتم التحكم في التطور الطبيعي للعين بدقة بواسطة جينات متعددة وإشارات جزيئية. تؤدي التشوهات في هذه العوامل إلى أمراض العين الخلقية.
الجينات الرئيسية المشاركة في تطور العين
Section titled “الجينات الرئيسية المشاركة في تطور العين”| الجين | الوظيفة والأمراض المرتبطة |
|---|---|
| PAX6 | الجين الرئيسي لتكوين العين. تؤدي الطفرات إلى انعدام القزحية، الثلامة، صغر العين، وشذوذ بيترز |
| SHH | يقسم المجال البصري الواحد إلى عينين يمين ويسار. تؤدي الطفرات إلى العين الواحدة (سايكلوبيا) |
| PAX2 | ضروري لتكوين ساق العين وإغلاق الشق الجنيني |
جين PAX6 هو جين تحكم رئيسي ضروري لتكوين العين، وقد تم اكتشافه من أبحاث تطور ذبابة الفاكهة. في البشر، تم تحديده كجين مسبب لانعدام القزحية (aniridia). يقع جين PAX6 بجوار الجين الكابت للورم WT1 على الكروموسوم 11p13، وعند فقدان كليهما تظهر متلازمة WAGR (ورم ويلمز، انعدام القزحية، تشوهات الجهاز البولي التناسلي، التخلف العقلي).
تشوهات مسار إشارات حمض الريتينويك
Section titled “تشوهات مسار إشارات حمض الريتينويك”حمض الريتينويك (RA) هو جزيء إشارة ضروري لتطور العين 1). يتم تحويل الريتينول (فيتامين أ) إلى الريتينال بواسطة RDH10، ثم إلى RA بواسطة ALDH1A1 وALDH1A2 وALDH1A3 1).
في البشر، ترتبط الطفرات في أربعة جينات لمسار إشارات RA: RBP4، STRA6، ALDH1A3، RARB، وكذلك PITX2، FOXC1 المنظمة بواسطة RA، بانعدام العين وصغر العين 1).
تسبب طفرات PITX2 متلازمة أكسفيلد-ريجر، وتسبب طفرات FOXC1 تشوهات الجزء الأمامي للعين 1).
أمراض العين الخلقية الناتجة عن تشوهات النمو
Section titled “أمراض العين الخلقية الناتجة عن تشوهات النمو”الكولوبوما (عيب المشيمية) هو تشوه خلقي يحدث بسبب عدم اكتمال إغلاق الشق الجنيني. يبدأ إغلاق الشق الجنيني من الجزء الأوسط في الأسبوع السادس من الحمل ويكتمل في الأسبوع السابع. إذا تعطل الإغلاق، يبقى شق يمتد من الحدقة إلى الأسفل، مما يؤدي إلى كولوبوما القزحية، كولوبوما المشيمية، كولوبوما عملاقة، وغالبًا ما يصاحبها صغر العين.
Q
ما هي أمراض العين التي تسببها طفرات جين PAX6؟
A
جين PAX6 هو جين تحكم رئيسي لتكوين العين. تسبب طفراته انعدام القزحية، الكولوبوما، صغر العين، شذوذ بيترز، ونقص تنسج البقعة. كما أن الفقدان المتزامن مع جين WT1 المجاور يؤدي إلى متلازمة WAGR (ورم ويلمز، انعدام القزحية، تشوهات الجهاز البولي التناسلي، التخلف العقلي).
6. الفيزيولوجيا المرضية وآليات الحدوث التفصيلية
Section titled “6. الفيزيولوجيا المرضية وآليات الحدوث التفصيلية”يتناول هذا القسم بالتفصيل عملية تطور أنسجة العين المختلفة بالتسلسل الزمني.
تكوين الكأس البصري والحويصلة العدسية (الأسبوع 4-6 من الحمل)
Section titled “تكوين الكأس البصري والحويصلة العدسية (الأسبوع 4-6 من الحمل)”في بداية الأسبوع الثالث من الحمل، يظهر أخدود بصري في الجزء الأوسط من الصفيحة العصبية. هذه هي بداية تطور الجهاز البصري. في نهاية الأسبوع الثالث، يتوسع جانبا الحفرة البصري بشكل حويصلي لتتشكل الحويصلة البصرية.
في الأسبوع الرابع من الحمل، يقترب الجدار الأمامي للطرف البعيد للحويصلة البصرية من الأديم الظاهر السطحي، ويتشكل الصفيحة العدسية. بعد ذلك، ينغمس الجدار الأمامي للحويصلة البصرية ليتشكل الكأس البصري، وتتثخن الصفيحة العدسية وتنغمس لتتشكل الحويصلة العدسية داخل الكأس البصري بحلول الأسبوع الخامس.
يظهر شق في الجزء السفلي من الكأس البصري (الشق البصري)، ويظهر شق أيضًا في الجدار السفلي للساق البصري (شق الساق البصري). يُطلق على كليهما معًا اسم الشق الجنيني. يدخل الشريان الزجاجي المتفرع من الشريان البصري الظهري إلى الكأس البصري عبر الشق الجنيني. يبدأ الإغلاق من الجزء المركزي حوالي الأسبوع السادس من الحمل، ويكتمل في الأسبوع السابع.
تمايز الصفيحتين الداخلية والخارجية للكأس البصري
Section titled “تمايز الصفيحتين الداخلية والخارجية للكأس البصري”كل من الصفيحتين الداخلية والخارجية للكأس البصري تكونان في البداية ظهارة عمودية متعددة الصفوف، لكنهما تسلكان مسارًا مختلفًا بعد ذلك.
الصفيحة الداخلية تتثخن بسبب انقسام الخلايا النشط وتتمايز إلى شبكية حسية (شبكية عصبية). ومع ذلك، في المنطقة القريبة من حافة الحدقة، لا تتثخن بل تبقى ظهارة مكعبة بسيطة، وتشكل الأجزاء الظهارية من الجسم الهدبي والقزحية.
الصفيحة الخارجية تصبح أرق مع توسع الكأس البصري، وتظهر حبيبات الميلانين في نهاية الأسبوع الخامس من الحمل لتتمايز إلى ظهارة الشبكية الصبغية. الجدير بالذكر أن ظهارة الشبكية الصبغية هي النسيج الصبغي الوحيد في الجسم الذي لا ينشأ من خلايا العرف العصبي.
الجزء الذي تنعكس فيه الصفيحة الداخلية على الصفيحة الخارجية يشكل فتحة دائرية منتظمة تتجه للأمام، وهي الحدقة المستقبلية.
تطور العدسة
Section titled “تطور العدسة”عندما تنفصل الحويصلة العدسية عن الأديم الظاهر السطحي وتُحاط بالجزء الأمامي من الكأس البصري، يصبح الغشاء القاعدي للخلايا الظهارية أحادية الطبقة هو محفظة العدسة. تبقى خلايا الجدار الأمامي كظهارة عدسية أحادية الطبقة، بينما تمتد خلايا الجدار الخلفي إلى الأمام كـ ألياف العدسة الأولية.
في الأسبوع 6-7 من الحمل، يختفي تجويف الحويصلة العدسية ويتشكل النواة الجنينية الداخلية. تنقسم وتتكاثر خلايا المنطقة الاستوائية لتشكل النواة الجنينية الخارجية، ثم تضاف ألياف العدسة الثانوية تباعًا إلى الخارج منها. تستمر ألياف العدسة الثانوية في التطور طوال الحياة.
تنشأ العدسة من ظهارة الأديم الظاهر، ولا تشارك الأنسجة الوسيطة في تكوينها. خلال فترة الحمل، يتم تزويدها بالتغذية عن طريق الغشاء الوعائي للعدسة (المشتق من الشريان الزجاجي).
تمايز الشبكية العصبية
Section titled “تمايز الشبكية العصبية”من الصفيحة الداخلية للكأس البصري تتشكل الشبكية العصبية وظهارة القزحية والظهارة غير المصطبغة للجسم الهدبي، ومن الصفيحة الخارجية تتشكل ظهارة الشبكية الصبغية والظهارة المصطبغة للجسم الهدبي وعضلات القزحية الموسعة والعاصرة.
يتمايز الشبكية العصبية على مرحلتين.
المرحلة الأولى (التمايز العمودي): تتمايز طبقة الأرومات العصبية إلى طبقة الأرومات العصبية الداخلية والخارجية. من الطبقة الداخلية، تتمايز الخلايا العقدية أولاً، ثم خلايا مولر والخلايا ثنائية القطب والخلايا عديمة المحور والخلايا الأفقية. من الطبقة الخارجية، تتمايز الخلايا المستقبلة للضوء. تظهر المخاريط في الشهر الثالث من الحمل، والقضبان في الشهر الرابع.
المرحلة الثانية (التمايز الأفقي): يتقدم التمايز من القطب الخلفي إلى المحيط. يكتمل تطور الشبكية تقريبًا في الشهر التاسع من الحمل، باستثناء البقعة. يبدأ تمايز البقعة في الشهر السادس من الحمل، ويبدأ تكوين النقرة في الشهر السابع، ويستمر التكوين النسيجي حتى الأسبوع السادس عشر بعد الولادة.
تطور الجسم الزجاجي
Section titled “تطور الجسم الزجاجي”يتكون الجسم الزجاجي على ثلاث مراحل.
| المرحلة | التوقيت | الخصائص |
|---|---|---|
| الجسم الزجاجي الأولي | من الأسبوع السادس من الحمل | يشمل الشريان الزجاجي. تبقى قناة كلوكيه بعد الانحدار. |
| الجسم الزجاجي الثانوي | من الأسبوع التاسع من الحمل | شبكة لاخلوية. تشكل معظم الجسم الزجاجي الناضج. |
| الجسم الزجاجي الثالثي | أواخر الحمل | تشكل الألياف الهدبية (منطقة زين). |
عندما يتدهور الشريان الزجاجي ويختفي في أواخر فترة الحمل، يختفي أيضًا الجسم الزجاجي الأولي. تبقى الفروع التي تمتد على طول سطح الصفيحة الداخلية للكأس البصري كـشريان وريد شبكي مركزي.
تطور العصب البصري
Section titled “تطور العصب البصري”في الأسبوع السادس من الحمل، تظهر الخلايا العقدية الشبكية. تمر محاورها عبر الطبقة الداخلية للشبكية، وتخترق الصفيحة الداخلية للكأس البصري عند القرص البصري، وتمتد داخل الساق البصرية. بحلول الأسبوع السابع من الحمل، تصل إلى التصالب البصري، وتمتد عبر الجسم الركبي الوحشي إلى الفص القذالي.
في الشهر الثالث من الحمل، تتكون الأم الحنون من خلايا العرف العصبي حول الساق البصرية. بحلول الشهر الخامس من الحمل، تظهر الأم الجافية، وفي الشهر السادس، تتمايز الأم العنكبوتية. يبدأ تكوين الميالين في الشهر الخامس من الحمل في الجسم الركبي الوحشي ويتقدم نحو الشبكية.
تطور القرنية وزاوية الغرفة الأمامية
Section titled “تطور القرنية وزاوية الغرفة الأمامية”بعد انفصال الحويصلة العدسية في الأسبوع الرابع من الحمل، تتمايز الأديم الظاهر السطحي إلى ظهارة القرنية. في الأسبوع السادس من الحمل، تدخل خلايا العرف العصبي بين ظهارة القرنية والعدسة لتشكيل غشاء بومان وبطانة القرنية. ثم تدخل خلايا العرف العصبي مرة أخرى لتشكيل سدى القرنية.
في الأسبوع السابع من الحمل، تدخل خلايا العرف العصبي بين بطانة القرنية والعدسة لتشكيل الغشاء الحدقي وسدى القزحية. في الشهر الثالث إلى الرابع من الحمل، تتكون قناة شليم، ويظهر الغرفة الأمامية، ويتكون الشبكة التربيقية للزاوية أيضًا من خلايا العرف العصبي.
تطور القزحية والجسم الهدبي والمشيمية والصلبة
Section titled “تطور القزحية والجسم الهدبي والمشيمية والصلبة”القزحية: في الشهر الثالث من الحمل، تتكون ظهارة القزحية من طبقتين أمامية وخلفية من الحافة الأمامية للكأس البصري. تبدأ العضلة العاصرة للحدقة في التمايز في الشهر الرابع من الحمل وتكتمل في الشهر الثامن. تبدأ العضلة الموسعة للحدقة في التمايز في الشهر السادس من الحمل وتكتمل بعد الولادة. العضلات الخاصة بالقزحية مشتقة من الأديم الظاهر العصبي.
الجسم الهدبي: في الشهر الثالث من الحمل، تتشكل ثنيات في الصفيحتين الداخلية والخارجية للكأس البصري لتشكيل العمليات الهدبية. يتكون سدى الجسم الهدبي والعضلة الهدبية من خلايا العرف العصبي.
المشيمية: في الأسبوع الخامس من الحمل، تظهر حبيبات الميلانين في الظهارة الصباغية للشبكية، وتتحفز شبكة الشعيرات الدموية من النسيج المتوسط المحيط بالكأس البصري. في الشهر الرابع من الحمل، تتكون شبكة الأوعية الدموية المشيمية.
الصلبة: في الأسبوع السابع من الحمل، يبدأ تكوينها من خلايا العرف العصبي عند الحافة الأمامية للكأس البصري، وتمتد للخلف لتصل إلى القطب الخلفي في الشهر الخامس من الحمل.
تطور الجفن والغدة الدمعية والعضلات خارج العين والمحجر
Section titled “تطور الجفن والغدة الدمعية والعضلات خارج العين والمحجر”الجفن: في الأسبوع السادس من الحمل، تتكون ثنيتان فوق وتحت العين. في الشهر الثالث من الحمل، تلتحم مؤقتًا، وتبدأ إعادة الانفصال في الشهر السادس وتكتمل في الشهر السابع. ظهارة الملتحمة والرموش والغدد المختلفة (غدد مول، غدد زايس، غدد ميبوم) تتطور من الأديم الظاهر السطحي، بينما العضلة الدائرية للعين والصفائح الجفنية تتطور من الأديم المتوسط.
الغدة الدمعية: في الأسبوع العاشر من الحمل، تغزو الخلايا القاعدية لظهارة الملتحمة في منطقة القبو العلوي الصدغي النسيج المتوسط لتشكيل الغدة. قد لا يبدأ إفراز الدموع الانعكاسي حتى الأسبوع 1-3 بعد الولادة.
العضلات خارج العين: في الأسبوع الرابع من الحمل، تتجمع الأنسجة المتوسطة حول الكأس البصري لتشكل البدائيات. في الأسبوع الثامن، تتمايز العضلات المستقيمة الأربعة والعضلات المائلة الاثنتان، وينفصل العضلة الرافعة للجفن العلوي عن العضلة المستقيمة العلوية.
المحجر: تتكون عظام المحجر بشكل رئيسي من القمة العصبية، ويبدأ التعظم الغشائي في الأسبوع السادس من الحمل. تتطور العظام الوتدية والغربالية عبر التعظم داخل الغضروف.
دور إشارات حمض الريتينويك
Section titled “دور إشارات حمض الريتينويك”حمض الريتينويك (RA) يتحكم في مرحلتين مهمتين في تطور العين 1).
المرحلة الأولى: تكوين الكأس البصري (ما يعادل E8.5–E10.5 في الفأر) حمض الريتينويك ضروري لتكوين الكأس البصري عن طريق انغماد (طي) الحويصلة البصرية 1). على وجه الخصوص، يتم تثبيط انغماد الحويصلة البصرية البطنية في غياب حمض الريتينويك 1). ينتج Aldh1a2 حمض الريتينويك في اللحمة المتوسطة المحيطة بالعين في الفترة E8.5–E9.5، ويؤدي فقدان تخليق حمض الريتينويك في هذه المرحلة إلى عدم اكتمال تكوين الكأس البصري 1).
المرحلة الثانية: تشكل الجزء الأمامي للعين (بعد E10.5 في الفأر) يُنتج حمض الريتينويك في الشبكية الظهرية (Aldh1a1) والبطنية (Aldh1a3) وينتشر إلى اللحمة المتوسطة المحيطة بالعين المشتقة من القمة العصبية خارج الكأس البصري 1). يؤدي فقدان حمض الريتينويك إلى فرط تكاثر اللحمة المتوسطة، مما يسبب صغر العين، تشوهات القرنية، وتشوهات الجفن 1).
ينشط حمض الريتينويك Pitx2 في اللحمة المتوسطة المحيطة بالعين، ويحفز Pitx2 Dkk2 (مضاد WNT) لتثبيط إشارات WNT، مما يحد من فرط تكاثر اللحمة المتوسطة 1).
Q
كيف يشارك حمض الريتينويك في تطور العين؟
A
حمض الريتينويك (RA) هو مستقلب نشط لفيتامين A، ويتحكم في مرحلتين في تطور العين: تكوين الكأس البصري وتشكل الجزء الأمامي للعين. يُنتج حمض الريتينويك في الشبكية وينتشر إلى اللحمة المتوسطة المحيطة بالعين المشتقة من القمة العصبية، ويثبط إشارات WNT عبر مسار Pitx2-Dkk2. تؤدي الطفرات في جينات مسار إشارات حمض الريتينويك إلى أمراض العين الخلقية مثل انعدام العين وصغر العين.
7. أحدث الأبحاث والآفاق المستقبلية
Section titled “7. أحدث الأبحاث والآفاق المستقبلية”تحديد الجينات المستهدفة المباشرة لحمض الريتينويك
Section titled “تحديد الجينات المستهدفة المباشرة لحمض الريتينويك”تعمل إشارات حمض الريتينويك عبر ارتباط مستقبلات حمض الريتينويك النووية (RAR) بعناصر الاستجابة لحمض الريتينويك (RARE) للتحكم في النسخ 1). ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد الجينات المستهدفة المباشرة لحمض الريتينويك في تطور العين 1). يوجد آلاف من عناصر RARE في جينوم الفأر والإنسان، وتتغير تعبيرات آلاف الجينات عند فقدان حمض الريتينويك، مما يجعل تحديد الأهداف المباشرة أمرًا صعبًا 1).
النهج اللاجيني
Section titled “النهج اللاجيني”في الأبحاث الحديثة، تم تطوير طريقة لكشف ترسبات H3K27ac (علامة تنشيط الجينات) وH3K27me3 (علامة تثبيط الجينات) المعتمدة على حمض الريتينويك باستخدام ChIP-seq، ودمجها مع بيانات RNA-seq لتضييق نطاق الجينات المستهدفة المباشرة 1). إذا تم تطبيق هذه الطريقة التي تم إثباتها في الأنسجة الجذعية على تطور العين، فمن المتوقع التحديد الشامل للجينات المستهدفة لحمض الريتينويك 1).
نموذج إزالة جين Rdh10
Section titled “نموذج إزالة جين Rdh10”RDH10 هو الإنزيم الوحيد المسؤول عن الخطوة الأولى في تخليق حمض الريتينويك (تحويل الريتينول إلى ريتينال)، ويمكن لفئران Rdh10 المعدومة الجين البقاء على قيد الحياة حتى اليوم الجنيني 10.5، وتظهر عدم وجود نشاط لحمض الريتينويك في الحويصلة البصرية وتشوه في تكوين الكأس البصرية 1). هذا النموذج أسهل في التعامل التجريبي من النموذج الثلاثي المعدوم للجينات Aldh1a1/Aldh1a2/Aldh1a3، وسيكون نموذجًا مفيدًا لتوضيح آليات تكوين الكأس البصرية في المستقبل 1).
8. المراجع
Section titled “8. المراجع”- Duester G. Towards a Better Vision of Retinoic Acid Signaling during Eye Development. Cells. 2022;11(3):322.
- Morax S, Hurbli T. The management of congenital malpositions of eyelids, eyes and orbits. Eye (Lond). 1988;2 ( Pt 2):207-19. PMID: 3143607.
- Paulsen FP, Berry MS. Mucins and TFF peptides of the tear film and lacrimal apparatus. Prog Histochem Cytochem. 2006;41(1):1-53. PMID: 16798129.